间充质干细胞来源的外泌体与眼免疫性疾病

梁春兰 师 齐 刘 莲 钟敬祥

眼睛是一个典型的免疫赦免区，外来移植组织或其他抗原无法被眼部免疫系统识别和清除。眼睛有3层连续的防御机制以维持免疫赦免状态，包括有效的血-眼屏障(包括血-房水屏障及血-视网膜屏障)、调节性T细胞(regulatory cell,Treg)诱导的眼部微环境，以及前房相关性免疫偏离。然而一旦眼睛的免疫系统被破坏，眼部一些免疫性疾病可能会导致灾难性后果。临床上常见的眼免疫性疾病，如眼超敏反应、角膜移植排斥反应、自身免疫性眼病等，可严重地威胁人们的视力。然而目前临床上治疗眼免疫性疾病的药物或手术疗效仍有一定的局限性。

近年来，间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)因其免疫调节潜力而被广泛应用于免疫相关疾病的实验与临床研究。MSCs是具有自我更新和多向分化能力的多能干细胞，可以从许多组织中分离出来，如骨、脂肪组织、脐带、肝脏、羊水、胎盘以及牙髓等。MSCs主要通过旁分泌细胞外囊泡的机制介导细胞间通讯，例如释放外泌体。几乎所有的细胞都能分泌外泌体。MSCs像所有其他细胞一样产生外泌体，但也有一些差异。MSCs是已知产生外泌体的细胞类型中最多产的。这些外泌体不仅表达共同的表面蛋白CD9、CD81，而且还特异地表达一些黏附分子，如CD29、CD44和CD73。外泌体是一种无细胞的治疗方法，具有显著的治疗效益：它们易于分离、管理和存储，并且不会触发免疫排斥和成瘤的风险。与MSCs比较，间充质干细胞来源的外泌体(messenchymal stem cell-derived exosomes,MSC-EXOs)具有与MSCs相似的功能。由于纳米大小和脂质双分子层的结构，外泌体可以很容易地通过生物屏障，进入靶器官，从而发挥作用。MSC-EXOs也因此凭借自身优势发挥着细胞间通讯、物质传递和免疫调节作用，推动着纳米载药技术、基因工程等技术的发展。

一、MSC-EXOs的免疫调节作用

研究表明，不同来源的MSCs-EXOs可以有效地激活或抑制免疫反应，调控炎性反应、自身免疫，并参与肿瘤、感染性疾病和自身免疫性疾病的发展。MSC-EXOs可以通过调控多种免疫细胞从而调节先天性和适应性免疫反应。例如促进Treg分化、抑制树突细胞的分化和成熟、抑制T淋巴细胞的增殖与活性、抑制NK细胞的细胞毒性作用等。

1.MSC-EXOs调节先天性免疫反应:先天性免疫在作为人体防御的第一道防线，在早期炎性反应中发挥重要作用。MSCs可以调节多种类型的先天免疫细胞，如巨噬细胞、中性粒细胞、肥大细胞、NK细胞等。MSC-EXOs可以影响巨噬细胞的极化，即M1向M2表型的转化。巨噬细胞是先天免疫中的重要细胞，它们至少有两种分化形式，即M1型和M2型。促进炎症的M1型巨噬细胞在宿主抵御细菌和病毒感染中起着核心作用，而抗炎的M2型巨噬细胞与寄生虫感染、组织重塑、纤维化和肿瘤疾病相关。Sun等结果表明，脐带间充质干细胞来源的外泌体(umbilical cord mesenchymal stem cell-derived exosomes,UCMSC-EXOs)可诱导巨噬细胞表型极化，抑制炎症，促进脊髓损伤修复。类似地，Zhao等研究发现，脂肪间充质干细胞来源的外泌体(adipose stem cell-derived exosomes,ADSC-EXOs)可以通过携带的活性STAT3来减少巨噬细胞极化为M2型。NK细胞是先天免疫的主要效应细胞，可有效介导在炎性反应中杀死肿瘤细胞，调节免疫。目前关于MSC-EXOs与NK细胞相互作用的研究较少。Spaggiari等研究表明，MSCs在IL-2诱导下的可以抑制静息状态时NK细胞的增殖，而对激活状态时的NK细胞无效。然而，活化的NK细胞可以有效降解MSCs，这在应用MSCs治疗移植物抗宿主病时应予以考虑。MSCs/MSC-EXOs可以调控先天性免疫细胞，同样地免疫细胞也可能影响前者的功能，两者相互作用。可见，MSCs/MSC-EXOs与先天免疫细胞之间的免疫调控机制相当复杂。

2.MSC-EXOs调节适应性免疫反应：适应性免疫指后天获得的，是淋巴细胞在特定抗原刺激下做出的特异性反应，主要包括细胞免疫和体液免疫。T淋巴细胞是参与细胞免疫的淋巴细胞，受抗原刺激并转化为淋巴细胞。T淋巴细胞中有许多亚群，包括细胞毒性T细胞(CTL)、抑制T细胞(Ts)、Treg和辅助T细胞(Th)等。研究数据表明，T淋巴细胞在许多自身免疫性疾病和炎症性疾病的发生、发展中起着重要作用。MSCs-EXOs可影响T淋巴细胞的分化和功能调控。ADSC-EXOs可以抑制T淋巴细胞的分化、激活、增殖，以及促炎性细胞因子IFN-γ的产生。骨髓间充质干细胞来源的外泌体(bone marrow mesenchymal stem cell-derived exosomes,BMSC-EXOs)可诱导Th1转化为Th2，显著降低促炎性细胞因子TNF-α、IL-1β的水平，提高抗炎性细胞因子TGF-β的水平。B淋巴细胞也是重要的适应性免疫细胞，它介导体液免疫和分泌抗体。MSCs-EXOs可影响B淋巴细胞的状态和功能。Khare等将BMSC-EXOs和外周血单核细胞共培养，发现BMSC-EXOs通过调控活化B淋巴细胞mRNA可显著抑制B淋巴细胞的增殖、成熟，从而影响B淋巴细胞的功能。

二、眼免疫学疾病与MSC-EXOs的关系

鉴于目前来源于骨髓、脂肪及脐带组织的MSC-EXOs被广泛地研究，本文重点总结了BMSC-EXOs、ADSC-EXOs、UCMSC-EXOs在眼免疫性疾病的研究进展，包括干燥综合征角膜结膜炎、自身免疫性葡萄炎和同种异体角膜移植排斥反应。此外，一些可能与免疫相关的疾病也引起了越来越多的关注。年龄相关性黄斑变性(age-related macular degeneration, AMD)、青光眼、糖尿病性视网膜病变和其他与年龄相关的退行性眼病，被认为有很强的免疫学基础。

1.免疫相关性泪腺疾病：泪腺是眼部分泌免疫系统的主要组织。干燥综合征是一种慢性系统性自身免疫性疾病，具有外分泌腺和黏膜上皮淋巴细胞浸润和特异性自身抗体的特征，可引起眼干和口干。干燥综合征的发病机制是由Th1/Th17细胞和异常的Treg引起的免疫失衡，包括大量的B淋巴细胞和巨噬细胞聚集。巨噬细胞表型M1/M2极化在慢性炎症的过程中起着关键作用。Lu等研究表明，UCMSC可有效抑制兔模型中干燥综合征角膜结膜炎的炎症，从而恢复泪腺功能。这种效应可能部分归因于蛋白激酶B(protein kinase B,PKB)通路的激活，诱导巨噬细胞极化为抗炎M2表型，抑制巨噬细胞相关炎性细胞因子TNF-α、IL-6的分泌，增加抗炎性细胞因子IL-10、TGF-β的表达。

MSCs-EXOs可以通过Treg来发挥免疫调节能力。另有研究分别使用BMSC和BMSC-EXOs治疗干燥综合征的模型小鼠。研究表明，BMSC和BMSC-EXOs治疗：①成功地保留了小鼠唾液腺和泪腺的功能；②通过诱导病变周围更多的T淋巴细胞、下调TNF-α、IL-1β和上调IL-10来调节免疫；③与BMSC治疗比较，BMSC-EXOs具有安全性、生物利用度高、使用方便等优势。

2.同种异体角膜移植排斥：角膜移植是全球常见的移植形式，由于角膜无血管和淋巴管的特性，角膜作为移植组织具有相对的免疫特权。有研究报道，角膜移植失败的主要原因是同种异体移植排斥反应，其中抗炎Treg在识别同种异体抗原和促进移植耐受性方面发挥重要作用。目前对角膜移植排斥反应的药物治疗并不理想。Lu等把BMSC注射到大鼠的结膜下，发现角膜移植的存活率和透明度提高，水肿以及新生血管减少，这可能是由于CD4细胞和CD68巨噬细胞减少，抗炎Treg的增加有关。有证据表明同种异体的移植物释放的外泌体可以用于延长异体移植的存活率。然而，MSC-EXOs在角膜移植模型中疗效仍然缺乏直接证据。

3.免疫相关的葡萄膜疾病：葡萄膜炎是可导致失明的眼科疾病。虽然葡萄膜炎早期阶段的病因可能存在差异(特别是感染性和非感染性葡萄膜炎之间的区别)，但这是由一种快速、常见的炎症途径引起的，导致多种常见的临床表现。对于非感染性葡萄膜炎，如自身免疫性葡萄膜炎，是一种由T淋巴细胞介导的不适当的免疫反应。Xie等在实验性自身免疫性葡萄膜炎(experimental autoimmune uveitis,EAU)的小鼠模型中探究了BMSC-EXOs的作用，表明BMSC-EXOs通过下调TH1、TH17、Treg、抑制T淋巴细胞增殖，从而减轻EAU的临床及病理表现。但是Bai等通过在EAU的小鼠眼周注射UCMSC-EXOs，结果显示UCMSC-EXOs通过抑制白细胞迁移发挥治疗作用。然而，他们没有观察到UCMSC-EXOs对T淋巴细胞增殖的抑制作用，并表明UCMSC-EXOs抑制自身免疫反应炎症的机制并不依赖于T淋巴细胞抑制和凋亡诱导。如上所述，BMSC-EXOs和UCMSC-EXOs在EAU的小鼠模型中的分子机制似乎有很大的差别。笔者推测这种差异可能归因于MSC-EXOs组织来源上的差异造成不同的微环境。从不同来源MSC-EXOs的治疗潜力，特别是其抗炎和免疫调节机制，仍有待于进一步研究。

4.其他潜在的免疫相关眼病：青光眼是一种常见的与年龄相关的视神经疾病，是世界范围内失明的主要原因。一种自身免疫成分参与了青光眼的发病机制，而最直接的证据是在患者青光眼视网膜中检测到IgG抗体沉积。T淋巴细胞、B淋巴细胞、浆细胞和小胶质细胞在青光眼的进展中相互作用。研究表明，MSCs可能是视网膜神经节细胞保护的潜在治疗方法。Pan等研究表明，UCMSC-EXOs通过促进视网膜神经节细胞的存活和胶质细胞的活化而不是轴突再生，在神经保护中至关重要。值得注意的是，自身免疫与青光眼之间的关系仍存在争议。能否将青光眼亚型归类为自身免疫性青光眼，仍有待于进一步研究。

老年性黄斑变性(age-relatedmacular-degeneration,AMD)是一种进行性致盲疾病，是50岁以上不可逆转失明的主要原因。AMD的病理损伤积累视网膜色素上皮和Bruch膜，可导致晚期光感受器变性、玻璃膜疣样变性，地图样萎缩(干性/萎缩性)和脉络膜新生血管(湿性/新生血管性)。临床上针对湿性AMD患者主要采用玻璃体腔注射抗血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)的药物,费用较高且需患者较好的依从性进行多次药物注射。研究发现，MSC-EXOs显著抑制VEGF表达和分泌，且呈剂量依赖性。以上证据可以使笔者进一步了解AMD的病理情况，也可以为治疗AMD提供新的思路。

三、展 望

MSCs与MSC-EXOs比较，两种方式各有优缺点，例如MSCs可以直接运用于研究中，无需额外的分离和纯化步骤。但MSC-EXOs是一种无细胞的治疗方法，仍然具有一定的优势。目前MSCs常见的组织来源有骨髓、脂肪和脐带等，因此本文重点综述了BMSC-EXOs、ADSC-EXOs、UCMSC-EXOs在干燥综合征角膜结膜炎、同种移植角膜移植排斥反应和自身免疫性葡萄膜炎的研究进展。有趣的是，使用不同来源的MSCs或MSC-EXOs的不同研究在相似疾病模型中具有不同的分子机制，但均表明MSCs或MSC-EXOs具有一定的疗效。然而，MSCs或MSC-EXOs的免疫机制尚不完全清楚。不同组织来源MSC-EXOs的含量、免疫调节能力、分泌细胞因子谱等方面的差异是否对实验结果或结论产生影响，在今后的研究中仍需保持谨慎的态度。此外，除了不同的组织来源，实验中外泌体不同的分离方法、培养基和培养环境、建模引起的不同微环境、患者与动物疾病模型之间的区别等因素也同样值得注意。MSC-EXOs治疗不同疾病的基础方法尚不明确，最佳的MSCs来源、给药方式、剂量、临床的有效性及安全性等仍有待于进一步探索。否则，可能无法在临床上发挥MSC-EXOs的真正治疗潜力。