硒对核桃种仁抗氧化酶活性及果实品质的影响

唐 敏，杨开宇，张赛男，陈利英，刘 洋,2,3，张雪梅,2,3，齐国辉,2,3*

(1.河北农业大学林学院，河北 保定 071000；2.河北省核桃工程技术研究中心，河北 邢台 054000；3.河北省(邢台)

硒是维持人体健康所必需的微量元素之一[1]，也是对植物生长发育有促进作用的微量元素[2]，参与构成多种抗氧化酶活性的中心，如谷胱甘肽过氧化物酶、硫氧还蛋白还原酶等，在体内抗氧化过程中发挥重要作用[3]，适量的硒元素可以提高人体免疫力，延缓衰老，降低心血管疾病的发生，缺硒将导致一系列疾病的发生，如克山病、大骨节病等[4]。硒元素在人体内不能合成，只能通过外界食物吸收[5]，因此，富硒农产品成为人们最理想的补硒途径。近年来，人们对富硒农产品的研究也越来越多，开发了富硒大米、富硒茶叶等多种农产品。

硒在调控植物生长发育、改善农作物产量和品质、抗氧化方面的作用引人注目，有关硒在苹果[6]、葡萄[7]中的表现等方面研究得较多，研究发现喷施适量的硒肥能够改善葡萄果实品质，提高产量和果实硒含量[8]；硒还能缓解重金属对植物的毒害[9]，硒元素的施入可以改变镉胁迫下水稻植株的亚细胞分布，降低镉的活性化学形态和增强抗氧化防御系统，从而减轻镉胁迫对水稻的影响[10]。核桃(Juglansregia)作为人们经常食用的养生坚果，具有极高的营养和医疗保健价值[11-12]，深受人们喜爱。李财运等[13]研究了叶面喷施不同浓度亚硒酸钠对薄壳山核桃果实品质以及矿质元素的影响，表明硒元素促进薄壳山核桃果实发育与生长，影响种仁中营养元素的累积。但是硒对植物的促进作用体现在量的控制上，即低浓度促进、高浓度抑制[14]。有研究表明，适量的硒浓度能促进萝卜生长，提高产量，过量则会抑制其生长，还可能出现病变[15]，并且超过人体吸收的适宜浓度，硒元素也会对人体造成毒害，因此筛选出富硒农产品生产最适硒施用浓度尤为重要。而且叶面喷硒是提高果实硒含量、改善果实品质合理且有效的施肥方法[16]，可以提高硒元素的利用率。有关硒对核桃影响的研究还较少，尤其是硒对核桃种仁抗氧化酶活性的影响鲜见报道。本试验对核桃叶片喷施不同浓度的亚硒酸钠，研究其对核桃种仁抗氧化酶活性及果实品质的影响，探究核桃的最佳施硒量，为进一步研究硒调控核桃生理机制提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验地位于河北省临城县河北绿岭果业有限公司核桃示范基地，该地位于太行山南段东麓临城县的丘陵地区，海拔80～135 m，年平均日照时间2 653 h，年平均气温13.0 ℃，土壤类别为褐土，土层厚度多在40～100 cm，土壤有机质质量分数为0.6%左右，pH为7.7～7.9，土壤硒含量为0.12 mg/kg，属于低硒土壤[17]。试材为树龄15 a的‘绿岭’(‘Lvling’)核桃，株行距为3 m×5 m，试验园区排灌水条件良好，管理水平较高，无严重病虫害发生，树体健壮，生长和结果正常。

1.2 试验设计

试验于2020年进行，选择长势一致的15年生‘绿岭’核桃90株，进行叶面喷硒肥试验。硒肥采用分析纯亚硒酸钠，于核桃坐果初期、果实速生期、果实硬核期喷施3次，每株均匀喷施2.5 kg质量浓度为40、80、120、 160、200 mg/L的亚硒酸钠溶液，以喷施2.5 kg清水为对照(CK)。采用随机区组试验设计，5株为1小区，3次重复，小区间至少隔1株树作为保护株，试验树生长期均不喷施其他叶面肥，其他管理照常。

1.3 指标测定

于2020年8月下旬果实成熟期采集果实，每小区采集30个果，部分样品取仁保存于-80 ℃冰箱中，用于抗氧化酶活性的测定，其余脱青皮，洗净，晾干，用于坚果性状及内在品质测定。

坚果纵、横、侧径的测定：用精度为0.01 mm的游标卡尺逐个测量坚果的径长。单果质量的测定：用称重法测定随机抽取的20个果质量，然后求均值。出仁率的测定：从核桃初样中，随机抽取样品20个，逐个取仁，用精度为0.01 g的天平称取仁质量和坚果质量，计算仁质量与坚果质量之比，换算百分数，精确到0.01。

出仁率=(样品中所取仁质量/样品坚果总质量)×100%。

(1)

超氧化物歧化酶(SOD)活性采用氮蓝四唑光还原法测定[18]；过氧化物酶(POD)活性采用愈创木酚氧化法测定[18]；过氧化氢酶(CAT)活性采用过氧化氢法测定[18]；丙二醛(MDA)含量采用硫代巴比妥酸(TBA)法测定[18]；脂肪含量采用索式抽提法测定[19]；总蛋白质含量采用硫酸-过氧化氢消煮，凯氏定氮仪测定[20]；可溶性糖和淀粉含量采用蒽酮比色法测定[21]；可溶性蛋白含量采用考马斯亮蓝G-250染色法测定[21]；硒元素含量采用硝酸-高氯酸消煮，原子荧光分光光度计测定[22]。

1.4 数据处理

运用 Excel 2010 和 DPS 7.5、SPSS 21.0等软件统计与分析数据，采用 Duncan 新复极差法对数据进行方差分析。

2 结果与分析

2.1 不同浓度亚硒酸钠对核桃种仁抗氧化酶活性及MDA含量的影响

叶面喷施不同浓度亚硒酸钠溶液后，种仁抗氧化酶活性及MDA含量如图1所示。由图1可知，喷施亚硒酸钠溶液，促进了种仁SOD活性提高，随着亚硒酸钠溶液浓度的提高，种仁SOD活性呈现上升的趋势，均显著高于CK，喷施亚硒酸钠质量浓度40、80、120、160、200 mg/L,各处理较CK分别提高28.05%、30.49%、46.34%、50.61%、61.59%，喷施质量浓度为200 mg/L时种仁SOD活性最高，达到2.65 U/(g·min)；随着亚硒酸钠溶液浓度的提高，种仁POD活性呈现先上升后降低的趋势，在喷施质量浓度为80 mg/L时达到最大，为9.30 U/(g·min)；喷施质量浓度大于80 mg/L后，POD活性降低，当喷施质量浓度达到200 mg/L时，POD活性最低，显著低于CK，说明低浓度亚硒酸钠促进POD活性提高，高浓度则产生抑制作用；喷施不同浓度亚硒酸钠后，各处理种仁CAT活性均高于CK，喷施质量浓度为120 mg/L时达到最大，为246.98 U/(g·min)，显著高于CK和其他处理，较CK提高104.89%，与POD活性作用效果类似，低浓度亚硒酸钠促进CAT活性提高，高浓度产生抑制作用；喷施不同浓度亚硒酸钠溶液后，各处理下种仁MDA含量均低于CK，质量浓度为120 mg/L时，MDA含量最低，为2.27 μmol/g，显著低于对照和200 mg/L处理下的含量，质量浓度超过120 mg/L后，MDA含量逐渐上升。

不同小写字母代表各处理间0.05水平差异显著。The different lowercase letters represent significant differences at the 0.05 level.图1 喷施不同浓度亚硒酸钠溶液核桃种仁抗氧化酶活性及丙二醛含量Fig.1 Kernel antioxidant enzyme activities and malondialdehyde contents of walnut kernels by spraying different concentrations of sodium selenite solutions

2.2 不同浓度亚硒酸钠对核桃果实品质的影响

2.2.1 对核桃产量及外在品质的影响

叶面喷施不同浓度亚硒酸钠溶液后，核桃产量及果实外在品质如表1所示。由表1可知，随着亚硒酸钠溶液浓度的增加，核桃坚果产量也随之提高，但处理间差异不显著；叶面喷施亚硒酸钠溶液，促进了核桃单果质量的提高，随着亚硒酸钠溶液浓度的增加，这种促进作用逐渐增强然后减弱，当喷施质量浓度为40、80、120、160、200 mg/L时，单果质量较CK分别提高1.19%，4.14%，4.54%，6.85%，5.89%，亚硒酸钠质量浓度为160 mg/L时，单果质量最大，为13.42 g；喷施不同浓度亚硒酸钠溶液，各处理间种仁出仁率无显著差异；坚果横径、纵径均在喷施质量浓度为200 mg/L时达到最大，分别为33.86 mm和40.79 mm，坚果侧径在喷施浓度为160 mg/L时达到最大，为33.81 mm，显著高于CK；亚硒酸钠溶液质量浓度为80 mg/L时，果形指数最大，但各处理间无显著性差异。

表1 喷施不同浓度亚硒酸钠溶液后核桃坚果产量及外在品质

2.2.2 对核桃坚果内在品质的影响

叶面喷施不同浓度亚硒酸钠溶液后，核桃果实内在品质如表2所示，由表2可知，喷施亚硒酸钠溶液，促进了种仁可溶性糖的累积，随着亚硒酸钠溶液浓度的增加，这种促进作用逐渐增强然后减弱。当喷施质量浓度为40、80、120、160、200 mg/L时，可溶性糖含量较CK分别提高2.51%、6.03%、21.11%、17.59%、12.56%，当喷施质量浓度为120 mg/L时，可溶性糖含量最高，达到2.41%，显著高于CK；种仁淀粉含量在喷施质量浓度为80 mg/L时达到最高，为0.88%，该处理显著高于CK和其他处理，当喷施浓度为200 mg/L时，淀粉含量低于CK；喷施亚硒酸钠溶液，促进了种仁可溶性蛋白的累积，随着亚硒酸钠溶液浓度的增加，这种促进作用逐渐增强然后减弱，当喷施质量浓度为40、80、120、160、200 mg/L时，可溶性蛋白含量较CK分别提高7.14%、18.57%、20.00%、20.00%、4.29%；喷施亚硒酸钠溶液，促进了种仁总蛋白质的累积，在喷施质量浓度为200 mg/L时达到最大，为23.09%，显著高于CK及其他处理；种仁脂肪含量在喷施质量浓度为120 mg/L时达到最大，为70.70%，较CK增加3.26%；喷施亚硒酸钠溶液提高了种仁内硒含量，各处理均显著高于CK，种仁硒含量随着亚硒酸钠溶液质量浓度的提高而增加，含量为0.10～0.16 mg/kg，达到了富硒坚果行业标准[23]，在喷施质量浓度为200 mg/L时达到最大，为0.16 mg/kg，但是上升速率由快变慢。

表2 喷施不同浓度亚硒酸钠溶液后核桃坚果内在品质

2.3 硒与抗氧化酶活性、MDA含量以及果实品质的相关性分析

核桃种仁硒元素含量与种仁抗氧化酶活性、MDA含量以及果实品质的相关系数见表3。由表3可知，在抗氧化酶活性指标中，种仁硒元素含量与果实SOD活性呈极显著正相关，其相关系数为0.96，随着种仁内硒含量的增加，种仁SOD活性增强，表明硒元素促进种仁抗氧化性增强；种仁硒元素含量与果实MDA含量呈显著负相关，相关系数为-0.87，随着种仁内硒含量的增加，种仁MDA含量降低，表明硒元素促进种仁抵御外界逆境损伤，减少MDA的累积；在果实品质相关指标中，种仁硒元素含量与产量、单果质量、纵径、可溶性糖含量均呈极显著正相关，相关系数分别为0.89、0.92、0.91、0.77，与横径、侧径呈显著正相关，相关系数分别为0.82、0.81，随着种仁内硒含量的增加，果实品质有所提升。

表3 硒与抗氧化酶活性、MDA含量以及果实品质的相关性分析

2.4 硒对核桃种仁抗氧化酶活性及果实品质的主成分分析

以测定的17个指标为依据，应用主成分分析法综合评价喷施不同浓度亚硒酸钠对核桃种仁抗氧化酶活性及果实品质的影响，结果见表4。由表4可知，共提取出4个特征值大于1的主成分，累计方差贡献率达到97.613%，说明提取的4个主成分能够代表硒元素影响核桃综合性状的97.613%，因此可以选取前4个成分作为供试核桃综合性状的主成分。

主成分表达式用Y=aX表示，a为因子载荷量。第1主成分的函数表达式为：

Y1=0.320X1-0.099X2+0.113X3-0.246X4+0.323X5+0.308X6+0.115X7+0.308X8+0.292X9+0.289X10+0.002X11+0.299X12-0.044X13+0.189X14+0.212X15+0.264X16+0.311X17。

(2)

第1主成分的特征值为9.250，贡献率为54.411%，其中SOD活性、产量、可溶性糖含量、横纵侧径、单果质量、脂肪、总蛋白质和种仁硒含量在此主成分上有较高的载荷，说明这些是评价核桃综合性状的第1重要指标。

第2主成分的函数表达式为：

Y2=-0.040X1+0.462X2+0.363X3-0.255X4-0.076X5+0.031X6-0.058X7-0.157X8-0.055X9-0.085X10+0.276X11+0.059X12+0.467X13+0.381X14-0.284X15+0.107X16+0.090X17。

(3)

第2主成分的特征值为3.827，贡献率为22.512%，其中淀粉含量、可溶性蛋白含量、POD、CAT活性在此主成分上有较高的载荷，这些是评价核桃综合品质的第2重要指标。

第3主成分的函数表达式为：

Y3=0.085X1-0.046X2-0.373X3-0.019X4-0.028X5+0.159X6-0.486X7-0.073X8+0.256X9+0.142X10+0.489X11-0.219X12+0.247X13-0.066X14+0.211X15-0.282X16+0.146X17。

(4)

第3主成分的特征值为2.406，贡献率为14.154%，其中MDA含量、果形指数在此主成分上有较高的载荷，这些是评价核桃综合品质的第3重要指标。

第4主成分的函数表达式为：

Y4=0.114X1+0.262X2+0.192X3-0.163X4+0.096X5-0.202X6+0.472X7+0.082X8+0.168X9-0.350X10+0.240X11-0.127X12-0.002X13-0.303X14+0.389X15-0.316X16+0.087X17。

(5)

第4主成分的特征值为1.111，贡献率为6.537%，其中出仁率在此主成分上有较高的载荷，是评价核桃综合品质的第4重要指标。

根据主成分表达式计算各处理主成分得分，最后计算各品种的综合得分，C=0.544 11Y1+0.225 12Y2+0.141 54Y3+0.065 37Y4，计算结果见表5。由表5的综合评价结果可知：叶面喷施120 mg/L亚硒酸钠，核桃的综合性状表现最好，排名第1。

表4 亚硒酸钠处理下各性状因子载荷矩阵和贡献率

表5 不同浓度亚硒酸钠处理下主成分得分和综合得分

3 讨 论

硒与抗氧化酶活性、MDA含量以及果实品质的相关性分析表明，硒元素与核桃种仁抗氧化酶活性提高和果实品质改善具有显著相关。

喷施亚硒酸钠在一定程度上促进了叶片和果实内SOD、POD、CAT活性提高，减少了MDA累积，增强了核桃植株的抗氧化性，这与有关葡萄[24]、番茄[25]方面的研究结果一致，这是因为叶面喷施亚硒酸钠后，在植物体内将无机硒转化成有机硒，有机硒主要以含硒蛋白的形式存在，如谷胱甘肽过氧化物酶、硫氧还蛋白还原酶等，这些含硒蛋白协同其他酶共同作用，协调体内抗氧化系统，通过增加抗氧化酶含量和提高酶活性，促进植株抗氧化能力增强，清除体内产生的自由基。段咏新等[26]在研究硒元素在大蒜体内的生物富集及抗氧化作用中表明，喷施一定的外源硒后，大蒜体内会产生一种含硒蛋白，能提高大蒜的抗氧化能力。

适量的硒元素可以促进植物的生长发育，但当硒浓度达到一定值时，生长发育就会受到抑制[27]。Hartikainen等[28]以黑麦草为试验材料得出，硒具有双重作用：在低质量浓度下硒可作为抗氧化剂，抑制脂质过氧化，而在较高质量浓度下，硒可作为促氧化剂，增强脂质过氧化产物的积累。本试验中，亚硒酸钠质量浓度大于120 mg/L后，POD活性降低，说明低质量浓度亚硒酸钠促进抗氧化酶活性提高，高浓度则起抑制作用；喷施质量浓度为160 mg/L的种仁CAT活性显著高于200 mg/L的处理，亚硒酸钠质量浓度超过120 mg/L后，MDA含量逐渐上升，质量浓度超过160 mg/L后，单果质量、可溶性蛋白含量开始降低等，同样说明低浓度促进核仁内含物质的累积，高浓度则起抑制作用。适量的亚硒酸钠可改善核桃果实的外观品质以及内在品质，本试验研究表明，适量的硒元素可提高核桃单株产量，显著提高单果质量、横径、纵径、侧径等外观指标，提高种仁可溶性糖、可溶性蛋白、总蛋白质、脂肪含量，改善了核桃果实内在品质，这是由于硒元素能提高叶片光合色素含量和叶片质量，促进作物光合作用，从而获得更多产量和更高的品质，高浓度硒会抑制作物光合作用，果实内在品质指标就会降低[29-30]，这与贾莉芳等[31]的结果一致。王清华等[32]对冬枣喷施了不同浓度的亚硒酸钠，得出了类似的结论，当硒的质量浓度为50 mg/L时，是对冬枣最合适的施硒浓度；慈琰雨[33]对苹果的研究表明，叶面喷硒显著增加了‘红将军’果实的可溶性固形物含量，有效改善果实品质，对提高果实品质具有积极意义。同时，叶面喷施亚硒酸钠可显著提高核桃种仁内硒含量，与在梨树[34]、猕猴桃[35]、桃[36]树上施用外源硒肥结果一致，并且随着亚硒酸钠浓度的升高，种仁内硒含量也逐渐升高，上升速度逐渐变慢，可能即将达到硒耐受度。

适量的喷施亚硒酸钠，可提高核桃种仁抗氧化酶活性，减少MDA累积，增强核桃植株的抗氧化性，改善核桃果实的外观品质以及内在品质。利用主成分分析综合评价可知：叶面喷施120 mg/L亚硒酸钠，核桃的综合性状表现最好。