慢性高眼压作用下视网膜功能及筛板形态改变

张景茜 任璐頔 钱秀清，2

0 引言

青光眼作为不可逆致盲眼病之一，现已影响全球超过7 000万人，且患病人数逐年上升，有研究预计，到2040年全球患青光眼患者比例为3.54%，患病人数将上升至1.1亿[1]。目前青光眼的发病机制尚未明确，但研究发现病理性眼压升高是青光眼发病的重要影响因素。建立慢性高眼压动物模型是研究青光眼发病机制的主要手段之一，常用的实验动物包括猴、兔、鼠等[2-3]，由于鼠与灵长类动物角膜缘有相似的解剖结构，且其眼压升高后能产生视网膜神经节细胞变性、视神经纤维丢失等与人眼青光眼相似的病理变化[4]，除此外还有操作方便、成本较低等优势，因此应用广泛。

慢性高眼压的作用会影响视网膜和视神经的光学功能[5-8]，视觉电生理技术可以检测视网膜和视神经功能学的改变。视神经发源于视网膜的神经节细胞层，神经节细胞轴突延伸到视神经乳头处，穿出筛板从而形成有髓视神经。视网膜在受到图形或者光的刺激之后，光感受器细胞内会引起光化学反应和光电反应，产生电位改变并形成神经冲动，视觉电生理技术可对这种电位变化进行记录与处理[9]，并无创、客观地对视功能进行检测与评估。视觉电生理技术主要包括闪光视网膜电图(flash electroretinogram，F-ERG)、闪光视觉诱发电位(flash visual evoked potential，F-VEP)等[10-11]。目前，有大量研究通过对慢性高眼压模型进行视觉电生理的测试，获取慢性高眼压作用下视网膜功能学的损伤规律。有研究发现在慢性高眼压模型建立3周后，F-ERG的a波振幅显著下降，而b波与振荡电位(oscillatory potential，OP)波的振幅较为敏感，于建模后1周就出现下降情况。此外，VEP的潜伏期在建模2周后显著延长，同时其振幅显著下降[5-7]。慢性高眼压作用下视网膜功能学的损伤可能发生在造模后1～3周之间，且损伤随着高眼压作用时间的延长而呈现进行性趋势。

视网膜功能学的改变可能与视神经穿过筛板时受到的挤压作用有关。视神经轴突通过筛孔穿出眼球，研究发现眼压升高会导致筛板变形，从而挤压视神经，影响视神经中的轴浆运输和视神经功能学的改变[12-14]。有研究发现，眼压升高会导致筛板微观结构发生改变，如部分筛孔形状从圆形变为椭圆形[15-16]。筛板微结构的变化可能导致视神经轴突的损伤，有研究在诱导高眼压模型后，在电镜下观察到视神经轴突严重损伤且轴突密度显著下降[3]。因此，研究高眼压作用下筛板微结构的改变对青光眼致病机制的研究有重要意义。

本研究通过烙闭巩膜上静脉结合球结膜下注射氟尿嘧啶以获得慢性高眼压大鼠模型，对其进行眼压监测，综合考虑慢性高眼压作用下视觉电生理与形态学的改变，选择慢性高眼压造模后2周和4周作为时间观察点；对大鼠进行视觉电生理测量，通过激光共聚焦显微镜观察筛板组织图像，并计算筛板组织孔隙率。最终得到鼠眼的视网膜功能和筛板形态随着高眼压持续作用的变化规律，为青光眼致病机制研究提供基础。

1 材料和方法

1.1 实验动物

选取健康、雄性成年SD大鼠，体重介于300～450 g，双眼角膜状况良好、眼底正常、屈光间质清，且无其他全身疾病。本实验采取自身对照方案，左眼作为对照组，右眼为实验组。实验动物由首都医科大学动物部提供，在温度和湿度适宜的环境中饲养，保证昼夜12 h交替，并提供标准的水和食物。实验遵循中国科学技术委员会颁发的《实验动物管理条例》，并严格按照国际眼科和视觉科学研究中动物实验的 ARVO 声明进行处理。

1.2 眼压测量

分别对处在清醒状态下的正常大鼠和造模前、造模后2 d以及造模后每周的慢性高眼压模型大鼠进行眼压测量，保证在每日同一时段内(15∶00-16∶30)由专人使用TonoLab眼压笔(iCare，芬兰)进行测量工作。眼压笔在测量时应保证笔头垂直且轻触在鼠眼角膜中央处，勿过度用力，选取3次有效测量值的平均值作为该眼的最终眼压值。

1.3 慢性高眼压模型建立

大鼠腹腔注射1%戊巴比妥钠进行全身麻醉后，烙闭巩膜上静脉，然后在球结膜下注射氟尿嘧啶(上海旭东海普药业有限公司)。左眼作为对照眼，不作处理。之前的研究已经证明造模使用的药物氟尿嘧啶对眼压没有影响[17]，因此本次实验没有建立药物对照组。

1.4 闪光视网膜电图测量

分别对正常大鼠和造模后2周、4周大鼠各6只用Espion E3视觉电生理仪(Diagnosys，美国)进行闪光视网膜电图的测量。

实验前对大鼠进行完全暗适应(时间定为2 h)，腹腔注射1%戊巴比妥钠进行全身麻醉，右眼滴入散瞳滴眼液(日本参天制药有限公司)并散瞳20 min。记录电极为环状电极，分别置于双眼眼角巩膜缘；参考电极为针状电极，置于大鼠鼻内；接地电极平行于身体置于尾部。实验使用全视野刺激器，按照国际临床视觉电生理学会标准化方案顺序记录视杆反应、最大混合反应、振荡电位，明适应10 min后记录视锥反应及闪烁光反应(30 Hz)。

闪光视网膜电图的典型波形如图1所示，a波是一个负相波，起源于感光细胞的内段，其振幅的变化主要反映视网膜感光细胞层功能变化；b波是ERG中的正相成分，它起源于视网膜的内核层，其振幅的变化可反映视网膜第二级神经元和放射状神经胶质细胞的功能变化；OP由一组小波组成，它们重叠出现在 b波的上升支上，反映内核层至内丛状层功能。由于OP2子波受a波幅值影响较小，幅值较高，波形稳定，故以OP2作为OP 参数中的重要指标之一。本实验主要观察指标包括：Rod-ERG的b波潜时、幅值；Max-ERG的a、b波潜时、幅值；OP的平均幅值与OP2子波的潜时、幅值；Cone-ERG的a、b波潜时、幅值；Flick-ERG的峰值幅值。

图1 F-ERG典型波形

1.5 闪光视觉诱发电位测量

分别对正常眼压和造模后2周、4周各6只大鼠用RETI-port/scan 21罗兰视觉电生理仪(Roland Consult，德国)进行闪光视觉诱发电位的测量。

实验前打开实验台的水浴加热装置，在实验过程中保持实验台温热。实验时，腹腔注射1%戊巴比妥钠进行全身麻醉，双眼滴入散瞳液并进行20 min的散瞳，两耳连线中点处备皮，放置电极。记录电极置于两耳连线中点皮下，平行于身体长轴；参考电极插于耳郭，接地电极置于尾部。开始测试前应保证各电极阻抗小于5 kΩ。将大鼠置于刺激器内，测量眼向内，非测量眼用自制不透光眼罩盖住。测量顺序为先测量实验眼，再测量对照眼。在测量过程中保证周围环境其余电源全部关闭，避免产生干扰。

根据国际临床视觉电生理学会标准化方案对大鼠进行F-VEP测试。采用全视野刺激器，参数设置为：闪光颜色白色；刺激频率1.6 Hz；叠加次数100次。每只眼连续测试3次，取其平均值作为最终结果记录。闪光视觉诱发电位的典型波形如图2所示，负相波用N表示，正相波用P表示，相邻两波间的幅值差大小反应视神经轴索功能状态，波形出现的时间点为潜时，其反应视神经髓鞘功能状态。本实验主要观察指标包括N1、P1、N2、P2潜时，N1-P1、N2-P2幅值。

图2 F-VEP典型波形

1.6 孔隙率计算

选取正常和造模后2周、4周各6只大鼠进行筛板形态学的观察。以10 μm厚度对筛板组织进行连续冷冻切片，一个样本约保留160 μm，即16张切片，然后通过胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein, GFAP)对组成其主要结构的星形胶质细胞进行荧光标记。通过LeicaTCS SP8正置激光共聚焦显微镜(Leica，德国)的油镜(物镜放大倍数为60倍)对筛板部位组织切片进行图像采集，将得到的图像导入ImageJ(NIH，美国)进行筛孔面积和筛板面积的获取，并计算孔隙率：孔隙率=孔隙面积/总面积。

1.7 统计学分析

2 结果

2.1 眼压测量结果

通过对18只正常大鼠清醒状态下的眼压测量(15∶00-16∶30)，得到大鼠正常眼压左眼为(12.58±1.47)mmHg，右眼为(13.17±2.21)mmHg。

开展教研活动的主要目的是提高教师的专业素质、教学能力以及课程实践能力。而若想有效开展好教研活动，以真正发挥出其作用、实现其目的，首先必须要确保教研活动的科学规划，即明确教研主题，找准问题所在，将教研活动当作一项科研活动来开展，并保证其有序进展。

随机抽取12只大鼠，对这12只大鼠行烙闭巩膜上静脉结合氟尿嘧啶球结膜下注射方法，以获得慢性高眼压模型，分别于烙闭前及烙闭后2 d、1周及每周进行眼压测量。烙闭前，实验眼、对照眼眼压分别为(14.25±2.09)mmHg、(12.70±1.89)mmHg。术后2 d，实验眼眼压显著上升(P<0.01)，烙闭后1～ 4周，实验眼眼压维持较高状态(P<0.01)。大鼠双眼眼压变化如图3所示。

图3 大鼠双眼眼压

2.2 闪光视网膜电图测量结果

由Diagnosis Espion E3测量得到正常、造模后2周、4周大鼠双眼的F-ERG各参数值，每个时间段各6只，所有被测大鼠均能得到典型的ERG波形，记录的各反应参数值如表1所示。

表1 F-ERG结果(n=6)

F-ERG各波形参数分析如下：

(1) 暗适应视杆反应Rod-ERG：造模后2周、4周大鼠与正常大鼠相比，b波潜时无显著变化(P>0.05)。高眼压作用2周后大鼠的b波幅值与正常大鼠、高眼压作用4周相比均无显著变化，高眼压作用4周时b波幅值与正常大鼠相比显著下降(P<0.01)，说明视杆细胞功能下降。

(2) 暗适应最大混合反应Max-ERG：高眼压作用前后a、b波潜时均无明显改变。高眼压作用4周时，与正常大鼠相比，a、b波幅值均显著下降(P<0.01)，但与高眼压作用2周相比无明显差别。反映了在慢性高眼压的作用下，视网膜光感受器层功能受损。

(3) 振荡电位OP：高眼压作用前后OP平均幅值与OP2潜时均无显著变化。高眼压作用4周时，OP2幅值与高眼压作用2周时对比，显著下降(P<0.05)，但与正常组相比无明显变化(P>0.05)。

(4) 明适应视锥反应Cone-ERG：高眼压作用前后a、b波潜时和a波幅值无明显变化。高眼压作用4周后，b波幅值与正常大鼠相比显著下降(P<0.05)，这表明视锥细胞功能在慢性高眼压作用下降低。

2.3 闪光视觉诱发电位测量结果

由罗兰视觉电生理仪测量得到F-VEP各参数值，白光刺激频率为1.6 Hz。每只眼测量3次，取其平均值作为最终结果。记录的各参数值如表2所示。

表2 F-VEP结果(n=6)

造模2周时，P1潜时与正常大鼠相比显著降低(P<0.01)，N2潜时显著升高(P<0.01)，且显著差异持续到建模后4周，但高眼压作用2周、4周间P1潜时与N2潜时无显著差别；高眼压作用4周时，N1-P1幅值与造模后2周相比显著性降低(P<0.01)，但与正常大鼠相比无显著差异；造模前后P2潜时、N2-P2幅值无显著变化。

2.4 孔隙率结果

经过GFAP荧光染色后的筛板部位组织切片图像如图4所示，绿色荧光处为筛板组织，其中孔隙处为视神经轴突穿过区域；局部放大图像如图5所示，可以看到在持续高眼压作用下，筛板胶原组织的放射状形态被破坏，出现杂乱的胶原纤维和异常的组织间隙。

图4 GFAP染色后筛板组织图像

图5 GFAP染色后筛板组织局部图像

将图像导入ImageJ后，将其改为灰度图像，选取筛板组织边缘(图6A)，获取整体筛板组织面积；分割出筛板从而计算筛孔面积(图6B)，由孔隙率公式计算获得筛板孔隙率。

图6 筛板组织图像分割

造模前后筛板组织部位孔隙率情况如图7所示，高眼压作用2周，筛板组织的孔隙率显著下降(P<0.01)。高眼压持续作用4周后，鼠眼筛板孔隙率较正常大鼠相比无显著性差异。

图7 筛板孔隙率变化情况(n=6)

3 讨论与结论

本研究中通过建立动物模型研究慢性高眼压作用下鼠眼筛板部位的损伤情况，造模方法采取课题组中已成熟使用的烙闭上巩膜静脉结合球结膜下注射氟尿嘧啶法[17]，为维持实验大鼠高眼压状态，定期对其进行眼压测量，并对眼压低于25 mmHg的大鼠再次烙闭，实验结果显示，大鼠实验眼眼压在烙闭后2 d显著上升且能维持高眼压状态到4周。

通过F-ERG和F-VEP的测量，本研究得到慢性高眼压作用下视网膜功能的损伤情况。结果显示，在慢性高眼压作用2周后，F-VEP的潜时显著增长，这与ElGohary等[7]观察到的F-VEP变化结果一致。Yu等[18]、Chen等[19]同样发现慢性高眼压2周后，VEP的N1、P1潜时增长，平均幅值下降。慢性高眼压作用4周后，F-ERG的各反应幅值显著下降，这与同一课题组的郭学谦等[20]所得到的幅值下降结果相似，且与Wu等[6]、Hannon等[21]得到的慢性高眼压作用下视网膜损伤结果相似。本实验中仅通过测量F-ERG和F-VEP来评估视网膜的功能性改变情况，目前有研究发现，F-ERG的b波后会产生一负相波，即明视负波反应(photopic negative response，PhNR)，反映外层视网膜功能，该指标在早期青光眼患者中就可发生显著变化，对于早期青光眼的发现有重要意义[22]。在下一步工作中，可以增设对PhNR指标参数的观察，获得其在慢性高眼压作用下的变化规律。

研究结果显示，造模2周后，筛板组织孔隙率显著降低；造模4周后，筛板组织孔隙率与对照组相比无明显变化。视觉电生理结果显示,在造模2周后，视网膜功能已产生改变。此前其他研究者[23-24]发现在慢性高眼压模型的视觉功能学结果发生改变时，并未观察到明显的视网膜形态的变化，这可能是形态学测量的精度不够所导致的。此外，Liu等[25]研究发现，眼压升高2周后，ERG的a、b波幅值下降，而视网膜形态在高眼压作用4周后才出现显著变化。但Eastlake等[3]通过ERG测试与扫描电子显微镜观察发现,在高眼压作用2周后视网膜功能受损，同时观察到视神经的形态发生改变，与本文所观察到的结果相似。同样，Tan 等[26-27]通过ERG结合光学相干断层扫描的在体实验方法发现，大鼠眼压升高后ERG的a、b波幅值显著下降，同时视神经乳头的形态发生变化，但由于目前在体测试的图像精度较低，难以获得筛板微观结构的变化情况。

本文研究存在一定的局限性。由于本实验中慢性高眼压最长仅维持到4周，并未观察到完整的视网膜功能损伤、恢复情况。且在视觉电生理得到的结果中，实验眼与对照眼无法体现出显著性差异，这可能与视觉诱发电位幅度较低、极易受脑电波干扰等原因有关，在测量F-VEP的过程中，仅通过遮盖非测量眼来排除对侧眼的干扰，可能会由于大鼠的麻醉深度浅或自身呼吸起伏而在测量过程中发生活动，导致遮盖效果下降。另外，本研究所使用的显微镜精度较低，并且图像处理分割方法较为粗糙，得到的形态学参数较少，难以得到准确的早期筛板微结构改变情况。在下一步工作中，拟采用分辨率更高的图像采集设备，如电镜或具有高分辨率模块的激光共聚焦显微镜，优化图像处理方法，增加慢性高眼压观察的时间点，进一步研究慢性高眼压作用下，视网膜功能学的改变与筛板微观结构改变之间的关系，为青光眼致病机制的研究及早期诊断提供依据。