临沂动植物园珍稀野生动物弓形虫感染的血清学调查

肖建旭 ， 孙艳争

(1. 河北农业大学动物医学院 ， 河北 保定 071000 ； 2. 中国农业大学动物医学院 ， 北京 海淀 100193)

弓形虫(Toxoplasmagondii)感染包括家养动物、野生动物和人类在内的几乎所有温血动物。近年来，临沂动植物园内野生动物如斑马、梅花鹿、平顶猴等频繁出现流产，而弓形虫病又是引起动物流产的主要原因之一，弓形虫一旦在园区内流行极可能造成人兽共患风险，因此本试验对临沂动植物园珍稀野生动物弓形虫感染情况进行调查。被誉为弓形虫检测金标准的改良凝集试验(MAT)是临床和流行病学调查中最常用于检测弓形虫的方法之一[1]，所以本调查在检测园内181只珍稀野生动物和园内流浪猫弓形虫IgG抗体水平时采用了MAT法。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 主要仪器设备和器材 荧光倒置显微镜(X71型号)，日本Olympus公司；水套式二氧化碳培养箱，美国Thermo公司；高速冷冻离心机(Centrifuge 5810R)，德国Eppendorf公司；冰箱(BCD-238S)，海尔集团；微量移液器，德国Eppendorf公司；电子分析天平，北京赛多利斯仪器系统有限公司。

1.1.2 试剂及材料 Vero细胞，中国农业大学汪明教授惠赠，由本实验室传代保存。弓形虫RH株速殖子，中国农业大学刘群教授惠赠，由本实验室传代保存。DMEM细胞培养液、磷酸盐缓冲液，均购自赛默飞世尔生物制品有限公司；胎牛血清，购自德国PAN-Biotech GmhH公司；100 mm细胞培养皿、96孔U型微量板，均购自Coming公司；β-羟基乙醇，购自北京奥科斯科技有限公司。福尔马林溶液：PBS和甲醛溶液按照6∶1配比。伊文思蓝染液：在100 mL PBS溶液中添加0.2 g伊文思蓝粉末，混合均匀。碱性缓冲液：含7.01 g NaCl、3.09 g H3BO3、2 g NaN3和4 g牛血清白蛋白，用24 mL 1 mol/L的NaOH调节pH至8.95，加入H2O2定容至1 000 mL，置于4～6oC保存备用。

1.2 调查对象 包括2个纲12个目20个科43种珍稀野生动物181头(只)和流浪猫41只。每只动物静脉采血0.5～2 mL，3 000 r/min离心5 min，分离血清，-20 ℃保存待检。以上动物均于2019年捕获检测，全部来源于临沂动植物园园区内，试验结束后全部放归园区，在动物馆舍内饲养。

1.3 MAT检测

1.3.1 Vero细胞扩增弓形虫速殖子 当Vero细胞单层铺满至80%左右时，接种弓形虫RH株速殖子，接种量为106～107个/瓶，待速殖子入侵细胞，细胞破裂释放出速殖子后，收集培养瓶内的悬液，然后以2 500 r/min离心10 min，弃去上清，加20倍沉淀体积的PBS进行洗涤，离心弃去上清，加适量PBS重悬沉淀，4 ℃保存备用。

1.3.2 MAT抗原悬液制备 收集到的弓形虫速殖子悬液经过10 mL注射器吹打，去除其中的细胞碎片，以2 500 r/min离心10 min，弃去上清，沉淀按1∶6加入福尔马林溶液固定24 h。将固定的速殖子悬液以2 500 r/min离心10 min，弃去上清，加入PBS重悬沉淀，2 500 r/min离心10 min，以上操作重复3次。最后用碱性缓冲液调整速殖子浓度为107个/mL，4 ℃保存备用。

1.3.3 MAT法检测弓形虫IgG抗体 96孔U型板中加入25 μL待检血清，稀释倍数分别为1∶20～1∶2 560，然后加入10 μL新鲜配制的抗原液(70 μL 2-巯基乙醇，100 μL 0.2%伊文思蓝，1 mL 1.3.2中制备的抗原悬液)，振荡混合均匀，用铝锡纸密封，置于37 ℃保存，于24～72 h后观察结果。结果判定：若抗原抗体结合物如地毯状平铺于孔底则为阳性；若抗原抗体结合物在孔底为纽扣状的凝集物则为阴性[2]。

1.4 统计学分析 所得数据使用SPSS 22.0 软件进行处理，技术资料用样本数和阳性率表示。采用单因素方差分析，比较馆舍开放程度、季节和饲料等因素对弓形虫IgG抗体阳性率的影响。P<0.05为差异显著，P>0.05为差异不显著。

2 结果

2.1 珍稀野生动物和流浪猫弓形虫感染情况 本试验共对181头(只)珍稀野生动物和41只流浪猫的血液样本进行弓形虫IgG抗体检测，珍稀野生动物中一级动物有14种61头(只)，二级动物有21种95头(只)，三有保护动物及山东省重点动物有8种25头(只)。结果如表1所示，临沂动植物园珍稀野生动物弓形虫IgG抗体阳性率为38.12%；41只流浪猫弓形虫IgG抗体阳性率为21.95%。主要检测结果见表1。

2.2 不同种属动物弓形虫IgG抗体阳性率分析 不同种属动物弓形虫IgG抗体阳性率从高到低排序：鸡形目54.55%、雁形目52.27%、偶蹄目47.06%、鹤形目42.86%、灵长目33.33%、有袋目20.00%、鹳形目16.67%、肉食目4.76%、长鼻目0。

2.3 馆舍开放程度、食性、季节与弓形虫IgG抗体阳性率的关系分析 本调查中有101头(只)野生动物生活在半封闭性馆舍内，其弓形虫IgG抗体阳性率为51.49%，其余80头(只)野生动物生活在全封闭性馆舍内，其弓形虫IgG抗体阳性率为26.25%，二者的阳性率差异显著(P<0.05)。草食类和鸟类动物弓形虫IgG抗体阳性率(47.06%和44.05%)明显高于肉食类动物弓形虫IgG抗体阳性率(4.76%)。按照动物食性不同，弓形虫IgG抗体阳性率从高到低排序为植食性动物(44.83%)>杂食性动物(33.33%)>肉食性动物(4.76%)，其中植食性动物和肉食性动物的阳性率差异显著(P<0.05)，杂食性动物和肉食性动物的阳性率差异显著(P<0.05)。同年夏冬两季分别检测黑颈天鹅、黑天鹅、大白天鹅和疣鼻天鹅4种珍禽的弓形虫感染情况，夏季弓形虫IgG抗体阳性率分别是60.00%、28.57%、0、25.00%，冬季弓形虫IgG抗体阳性率分别是100%、100%、33.33%和44.44%，经统计学分析，夏季和冬季弓形虫IgG抗体阳性率差异极显著(x2=7.291，P=0.007)。

2.4 不同性别、季节和生活地点流浪猫弓形虫感染情况 雄性流浪猫弓形虫IgG抗体阳性率为21.42%，雌性流浪猫弓形虫IgG抗体阳性率为23.08%，二者差异不显著(x2=0.906，P>0.05)。按照采样检查时间的分布，得出不同季节的流浪猫弓形虫IgG抗体阳性率分别为春季50.00%、夏季0、秋季16.67%和冬季30.77%。不同季节流浪猫弓形虫IgG抗体阳性率差异显著(P<0.05)。根据流浪猫主要生活地点划分，弓形虫IgG抗体阳性率分别为百鸟园33.33%、天鹅湖28.57%、食草动物散养区37.50%、狮虎山0、草食区14.29%、饲料室50.00%和广场0。

表1 临沂动植物园主要珍稀野生动物弓形虫IgG抗体检测Table 1 Seroprevalence of T. gondii antibodies in rare wild animals in Linyi Zoological and Botanical Garden

2.5 流浪猫与野生动物弓形虫感染情况相关性分析 根据野生动物馆舍分布情况和流浪猫主要生活地点，选取百鸟园、天鹅湖、草食动物散养区、狮虎山和草食区共5个片区进行分析。经Pearson相关分析，野生动物弓形虫IgG抗体阳性率与同区域流浪猫弓形虫IgG抗体阳性率成正比(R2=0.978，P<0.001)，说明野生动物弓形虫感染率与馆舍附近流浪猫弓形虫IgG抗体阳性率呈正相关。

3 讨论

弓形虫病的症状、病理变化虽有一定的特征，但必须进行实验室诊断，查出病原体或其特异性抗体方能确诊[3]。目前，群体动物感染弓形虫的情况主要通过抗体测试进行判断[4]。改良凝集试验(MAT) 是由美国学者Dubey等在直接凝集试验基础上经过改良而建立的检测方法，Dubey将几种免疫诊断技术比较后确认了MAT法是弓形虫抗体检测的金标准[1]，因此，本调查选定了MAT检测法开展研究。本调查选取的珍稀野生动物和流浪猫均无接种弓形虫疫苗史，血清中弓形虫IgG抗体阳性说明其感染过弓形虫。

本次调查发现，临沂动植物园园区内181头(只)珍稀野生动物弓形虫IgG抗体总体阳性率为38.12%，而北京、上海、成都、杭州和福州动物园的弓形虫IgG抗体阳性率分别为19.35%、35.00%、47.46%、21.19%和22.70%[5-9]，说明鲁南苏北地区野生动物弓形虫感染率较高，远远高于北京、杭州和福州等地。本园中频繁发生的斑马、梅花鹿等流产，不能排除与弓形虫病有关，后续将进一步有目的性地鉴别诊断。同群野生动物中冬季的弓形虫IgG抗体阳性率明显高于夏季，这可能与弓形虫卵囊对高温和紫外线敏感，卵囊在夏季孢子化率下降有关。与北京、上海、福州等地动物园[5-6,9]情况一致的是，临沂动植物园内野生动物弓形虫感染率与馆舍的开放度也有很大关联性，这主要是因为半开放性馆舍中，小型动物流浪猫、老鼠等可自由出入，其排泄物包含有弓形虫卵囊[10]，可能对动物饲料及环境造成潜在的威胁，从而导致草食类和鸟类动物弓形虫IgG抗体阳性率明显高于肉食类动物。动物采食被污染的饲料是感染弓形虫的一个重要途径[11]，本次调查中，在哺乳动物中，食肉性动物弓形虫IgG抗体阳性率明显低于植食性动物和杂食性动物。分析这一现象可能原因：首先是植食性和杂食性动物居住馆舍比较封闭，流浪猫不能进入，降低了感染的概率；其次是肉类和鱼类饲料全部经过科学冷冻后再解冻投喂，冷冻后饲料中的弓形虫卵囊存活率降低，极大地减少了感染的概率；另外，杂食性鸟类可采食地面昆虫或者蚯蚓之类的小动物，导致误吞入弓形虫而发生了感染。

本次调查中，雄性流浪猫弓形虫IgG抗体阳性率为21.42%，雌性流浪猫阳性率为23.08%，二者差异不显著(x2=0.906，P>0.05)，此结果与于晋海等[12]研究结果一致。本调查中不同季节流浪猫弓形虫IgG抗体阳性率差异显著(P<0.05)，这可能与环境温度影响弓形虫卵囊的存活率有关。流浪猫与园区其他动物间接接触途径主要包括：弓形虫阳性流浪猫排出卵囊污染馆舍、饲料、水源等，被动物接触或误食后感染；在争夺食物过程中发生肢体接触；流浪猫将弓形虫传染给鼠类，部分动物捕食老鼠后感染。本调查与赵娟等[5]研究结果一致，野生动物与馆舍及周边流浪猫感染弓形虫的趋势一致，野生动物弓形虫总体感染率与馆舍附近流浪猫弓形虫IgG抗体阳性率呈正相关。

本次调查说明，圈养野生动物中也存在较高的弓形虫感染率，加强对饲料、环境、从业人员的科学管理，不仅是保护珍稀野生动物的需要，更是减少人和多种动物弓形虫病互患风险的有效措施。