南瓜白粉病病原菌鉴定及抗性品种筛选

胡文婷，裴徐梨，荆赞革

（昆明学院农学与生命科学学院，云南 昆明 650214）

南瓜是葫芦科（Cucurbitaceae）南瓜属（）植物，起源于美洲大陆。白粉病是南瓜生产上的重要病害，能侵染除根之外的任何组织。严重情况下能导致南瓜果实数量下降和品质价值损失，甚至导致提前收秧。侵染瓜类的白粉病病原菌主要分为3个属：单囊壳属（）、内丝白粉菌属（）和白粉菌属（），其中的6个种是关键病原：、、、、和，而由引起的白粉病是全球葫芦科植物产量的主要威胁。

选育抗病的南瓜品种可在生产上减少化学农药的使用，节约劳动力。目前已有许多抗白粉病南瓜品种的报道，如四季绿南瓜、金香栗南瓜、兴蔬红蜜南瓜和华美2009等，这些品种都在试验当地取得了较好的品质、产量和抗病性。云南为高原山区省份，南瓜种植面积已超4.7万hm，良好的生产品种能带来较高的经济效益。

为进一步了解云南省昆明地区白粉病病原菌类型，本研究首先采用形态鉴定、致病性检测和分子鉴定的方法确定其种类，然后利用该类白粉菌对150份南瓜种质资源进行白粉病抗性鉴定，以期为云南省南瓜生产品种的选择提供指导意见，也为抗病新品种选育及抗性遗传分析奠定基础。

1 材料和方法

1.1 试验材料

1.1.1 植物材料

选取南瓜品种“正源2号蜜本”，用于白粉病病原菌的分离纯化。从市面采集150份南瓜种质资源（品种），用于白粉病抗性鉴定。

1.1.2 白粉病病原菌材料

白粉病病原菌取自昆明学院试验田自然发病的南瓜植株叶片。

1.2 试验方法

1.2.1 白粉病病原菌鉴定

1.2.1.1 白粉病菌的分离纯化 选取南瓜叶片上的单菌落于无菌水中，制成孢子悬浮液并喷施在健康的南瓜叶片上，后置于小拱棚中保温。待叶片发病，再次从单菌落上分离白粉病病原菌，重复上述操作。经过3次分离纯化后，在南瓜叶片上存在大量扩繁纯化后的白粉病菌，并活体保存，以备后续相关试验应用。

1.2.1.2 白粉病病原菌形态观察 挑取纯化后的白粉病病原菌制作临时玻片，在显微镜下观察分生孢子和分生孢子梗，再滴加3%KOH溶液观察纤维状体。

1.2.1.3 致病性检测 按照柯赫氏法则，使用喷雾法（孢子悬浮液浓度2.5×10～5.0×10个/mL）在3株南瓜叶片上回接白粉菌，检测致病性。

1.2.1.4 白粉病病原菌分子鉴定 使用OMEGA（D3195 HP Fungal DNA Kit）试剂盒提取南瓜白粉病病原菌总D N A。利用I T S 1（5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'）和ITS4（5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'）通用引物进行PCR扩增。反应体系为：2×Taq PCR Master Mix 25 μL，上下游引物各1 μL，DNA模板量2 μL，ddHO 21 μL。扩增程序为：预变性94 ℃ 90 s；变性94 ℃ 20 s，退火50 ℃ 20 s，延伸72 ℃ 60 s，30次循环；延伸72 ℃ 5 min；保温4 ℃。取2 μL PCR产物经过琼脂糖凝胶电泳检测后，送至测序公司进行测序。

获得的序列在NCBI网站上进行BLAST比对。利用Mega 6.0软件构建白粉病病原菌的系统发育树。方法参数为：邻接法，Bootstrap method 1000，Maximum Composite Likelihood，Partial deletion 95。

1.2.2 南瓜种质资源白粉病抗病性鉴定

利用分离纯化后的白粉病菌对150份南瓜种质资源进行苗期的抗病性鉴定。每个品种南瓜设置3次重复，每个重复种植3株。待南瓜苗长至3叶1心时期，用喷雾法（孢子悬浮液浓度2.5×10～5.0×10个/mL）接种纯化扩繁后的白粉病菌。保持温度23～27 ℃，相对湿度70%以上。14 d后观察南瓜苗发病情况，根据鉴定标准（表1）和病情指数判断种质资源的抗性表现，病情指数计算公式为：病情指数（DI）＝Σ（病级数×相应病级株数）/（总株数×最高级病级）×100。

表1 南瓜苗期抗白粉病情况鉴定标准

2 结果与分析

2.1 白粉病病原菌鉴定

2.1.1 白粉病病原菌形态鉴定

通过挑取分离纯化后的白粉病菌制作临时玻片并于显微镜下观察（图1），发现分生孢子呈椭圆形，长度为31.42±4.91 μm，宽度为18.36±1.51 μm。无性繁殖的分生孢子梗长度为140.56±31.67 μm，宽度为17.76±1.91 μm。每个分生孢子梗上着生2～6个分生孢子。滴加3%KOH溶液的孢子内呈现明显纤维状体。根据以上形态特征，初步判断该白粉菌为单囊壳属白粉菌。

图1 病原菌形态

将分离纯化后的白粉病菌接种在“正源2号蜜本”叶片上。5 d后叶片表面开始出现白色病斑，12 d后叶片表面白粉层较厚且连片。发病症状与自然发病的南瓜叶片状态相似。挑取白粉病菌再次镜检，形态特征与自然发病的白粉病菌一致。致病性鉴定该白粉菌为单囊壳属白粉菌。

2.1.2 白粉病病原菌分子鉴定

使用ITS1和ITS4通用引物对南瓜白粉病菌总DNA进行扩增，并对扩增产物进行测序，获得519 bp的序列，后在NCBI上比对，结果与单囊壳白粉菌（P）同源性高达99%，授权登录号为MZ798229.1。系统发育树显示（图2），中国南瓜白粉病与恬楼白粉病、赤豆白粉病聚为一类，均属于单囊壳属白粉菌。

图2 植物白粉病系统发育树

2.2 南瓜种质资源白粉病抗病性鉴定

用分离纯化后的单囊壳属白粉菌鉴定150个南瓜品种的苗期抗病性。用喷雾法接种白粉菌6 d后，部分品种叶片开始出现少量病斑。通过对150个南瓜品种3叶1心期病情调查，筛选出11个高抗病品种，15个高感病品种（表2）。其中高抗病品种均为中国南瓜，包括6个“蜜本类”南瓜品种、2个“香芋类”南瓜品种、2个“黑皮姜饼瓜类”品种和1个“籽用类”南瓜品种，其中香芋南瓜为免疫品种。

表2 高抗及高感白粉病南瓜种质资源

3 结论与讨论

单囊壳属白粉菌为目前报道最多的瓜类白粉病病原菌，在内蒙古、黑龙江、贵州和甘肃等地南瓜白粉病病原鉴定的报道中均得到证实。纤维状体是区分单囊壳白粉菌和二孢白粉菌的有效方法。前人已在美洲南瓜、中国南瓜和苦瓜中运用相同的方法成功区分两种白粉病菌。本研究中，通过形态鉴定及分子鉴定，确定南瓜白粉病菌为单囊壳属白粉菌。不同病原菌类型对南瓜的致病性可能存在差异，因此，此次南瓜种质资源的抗性鉴定致病菌采用单囊壳属白粉菌。

DNA的ITS序列测序分析能有效区分待测真菌的种属信息。朱链等运用ITS序列对6株野生大型真菌进行了鉴定。在黄瓜枯萎病拮抗真菌和金线莲内生真菌的研究中，也使用了同样的方法。本研究纯化病原菌的测序结果比对显示与单囊壳属白粉菌高度同源。进化分析显示，在不同植物上的相同种属病原菌均各自聚为一类，各分支置信度高，进化树构建可靠。

种质资源抗性鉴定能有效挖掘不同种质所蕴含的基因信息，为人工育种提供良好的原始材料。车顺风等通过对737份葡萄种质的白粉病发病调查，确定我国野生毛葡萄和变叶葡萄对白粉病具有良好抗性。王晓敏从23份甜瓜种质资源中筛选出1份白粉病免疫材料和3份高抗材料。屈淑平等从64份美洲南瓜中筛选出13份高抗白粉病的材料。本研究从150份南瓜种质材料中，筛选出11份高抗病品种，均为中国南瓜品种，其中的2份种质资源为云南本土南瓜品种。研究成果对指导农业生产具有重要意义，并为抗病基因挖掘和抗病品种培育奠定基础。