基于数据挖掘和网络药理学对腹泻型肠易激综合征的方证探讨

王璐 饶颖 周佳林 戴琦

1.江西中医药大学 南昌 330000 2.江西中医药大学附属医院 3.江西省中医消化病临床研究基地

肠易激综合征（irritable bowel syndrome，IBS）是一种以腹痛、腹胀为主要症状，与排便相关或伴有排便习惯改变的疾病[1]，临床常规检查尚无法解释这些症状。罗马Ⅳ标准将IBS的粪便性状，稀水样便的比例大于25%，块状便的比例小于25%的定义为腹泻型肠易激综合征（irritable bowel syndrome with predominant diarrhea，IBS-D）[2-3]。 中医认为IBS-D属于“泄泻”“腹痛”的范畴，其病位在肠，与肝、脾、肾等多脏腑有关；病性可由实转虚，虚实夹杂；病机为肝失疏泄，横逆犯脾，脾失健运，湿从中生，脾虚日久，脾阳不足，累及肾阳，脾肾两虚，并将其分为肝郁脾虚型、脾虚湿盛型、脾肾阳虚型、脾胃湿热型和寒热错杂型[4]。中医以整体观念和辨证论治为治疗原则，证型之间多有联系，为了进一步探索证型、方药之间的关联，本研究以数据挖掘技术和网络药理学为基础，对中药治疗脾虚湿盛型和脾肾阳虚型IBS-D的方证关系进行探讨分析。

1 材料和方法

1.1 资料收集 对中国知网（China National Knowledge Infrastructure，CNKI）、中国生物医学文献服务系统 （Chinese Biomedical Literature Service system，SinoMed）、万方期刊数据库（Wanfang Database）、维普中文期刊数据库（VIP Database for Chinese Technical Periodicals）四大中文数据库进行检索。以“腹泻型肠易激综合征”“肠易激综合征”“腹泻”等为关键词或主题词，搜索从建库至2020年12月的相关文献，提取相关的证型、方药等信息。根据纳入标准和排除标准剔除不符合要求的文献。

1.2 纳入标准与排除标准

1.2.1 纳入标准 采用中药内治法治疗脾虚湿盛型或脾肾阳虚型IBS-D的文献，且治疗有效，文献有明确的方剂及药物组成。

1.2.2 排除标准 （1）个案报道、综述类、动物类或实验类文献；（2）资料来源不清，方剂、药物不具体或信息严重缺失，且研究对象除IBS-D外合并有其他疾病的文献；（3）重复发表、研究数据雷同者，只收录其中发表时间最近的文献。

1.3 名词术语规范化 以卫生部“十二五”规划教材人民卫生出版社（第二版）《中药学》和2020年版《中华人民共和国药典》为参照，对因用药部位不同、存在别名、炮制方式等导致药物名称不统一情况进行规范，如：当归、当归身、当归尾等统称为当归，金铃子规范为川楝子，半夏曲、姜半夏统称半夏；若功效有异，则保留原名，如生地黄和熟地黄等。

1.4 数据处理 通过双人分别录入的方法将文献数据规范导入WPS Office Excel工作表，进行数据整理后筛选出高频中药，并利用IBM SPSS Modeler 18.1软件对脾虚湿盛型和脾肾阳虚型相关处方进行关联规则分析。

1.5 中药活性成分及靶点收集 利用中药系统药理学数据库与分析平台（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP） 数据库（http://tcmspw.com/tcmsp.php）、中医药百科全书（The Encyclopedia of Traditional Chinese Medicine，ETCM）数据库（http://www.tcmip.cn/ETCM）对整理出的中药进行活性成分收集，在TCMSP数据库中设置口服利用度（oral bioavailability，OB）≥30%、类药性（drug-likeness，DL）≥0.18。 利用UniProt数据库（https://www.uniprot.org/）对收集到的活性成分进行靶点比对。

1.6 疾病靶点收集 利用基因疾病关联数据库（Gene-Disease Association Database，DisGeNET）（https://www.disgenet.org/）、 人类基因综合数据库（Human Gene Comprehensive Database，GeneCards） （https://www.genecards.org/）、人类孟德尔遗传在线（Online Mendelian Inheritance in Man，OMIM）数据库（https://www.omim.org/）检索IBS-D相关靶点，筛重后进行记录整理。

1.7 靶点整理和可视化 对脾虚湿盛型和脾肾阳虚型IBS-D中的核心中药活性成分与疾病的交集靶点进行统计，并利用Cytoscape 3.9.0软件构建成分-靶点图。

1.8 蛋白互作网络（protein-protein interactions，PPI）构建 将所得关键靶点导入STRING数据库（https://string-db.org/），设置物种为人，置信度≥0.400，运用Cytoscape 3.9.0软件进行可视化处理。

1.9 基因本体（gene ontology，GO）和京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）富集分析 将关键靶点导入DAVID数据库（https://david.ncifcrf.gov/），设置物种为人，进行GO和KEGG富集分析，并对结果进行可视化处理。

2 结果

2.1 文献检索和数据汇总 文献检索提示脾虚湿盛型文献182篇，处方188个，中药145味，共使用2 149次；脾肾阳虚型文献133篇，处方135个，中药122味，共使用1 571次。

2.2 高频中药与关联规则

2.2.1 脾虚湿盛型 脾虚湿盛型IBS-D的前10味高频中药分别为白术（171次）、甘草（155次）、茯苓（150次）、党参（122次）、薏苡仁（87次）、陈皮（84次）、山药（81次）、白芍（69次）、砂仁（69次）、白扁豆（63次）。 见表1。将数据导入IBM SPSS Modeler 18.1软件，设置链接大小连续变化，其中线条粗细代表关联强度，绘制关联规则网络图，结果显示白术、甘草、茯苓、党参4味中药互为关联，且关联度较强。见图1。使用Apriori算法进行建模，进一步分析不同中药的配伍关系，设置支持度≥45.00%（前后项药物在所有处方中同时出现的概率），置信度≥90.00%（前项出现时后项药物出现的概率），最大前项数5，提升度≥1（大于1表明前后项药物之间的关联有效），按置信度排序，得到11条结果。见表2。结合高频药物和关联规则所示结果，推测白术、甘草、茯苓、党参为脾虚湿盛型IBS-D的核心中药配伍。

表1 治疗脾虚湿盛型IBS-D前10味高频中药

图1 中药治疗脾虚湿盛型IBS-D关联规则网络图

表2 中药治疗脾虚湿盛型IBS-D关联规则

2.2.2 脾肾阳虚型 脾肾阳虚型IBS-D的高频中药前10位分别为白术（111次）、补骨脂（94次）、肉豆蔻（91次）、茯苓（86次）、甘草（85次）、党参（74次）、吴 茱萸（70次）、白芍（67次）、五味子（60次）、山药（55次）。见表3。将数据导入IBM SPSS Modeler 18.1软件进行关联规则分析，结果显示补骨脂-肉豆蔻、白术-补骨脂、白术-茯苓、白术-肉豆蔻、白术-甘草、白术-党参、补骨脂-吴茱萸、补骨脂-甘草、肉豆蔻-吴茱萸关联性强。见图2。设置支持度≥45.00%，置信度≥90.00%，最大前项数5，提升度≥1，得到4条关联规则结果，其中2药2条，3药2条，分别为党参-白术；吴茱萸-补骨脂；吴茱萸+肉豆蔻-补骨脂；吴茱萸+补骨脂-肉豆蔻。见表4。结合高频药物和关联规则结果，推测中药治疗脾肾阳虚型IBS-D核心配伍或为补骨脂、吴茱萸、肉豆蔻，并根据临床情况辨证加入白术、甘草、党参、茯苓等药物。

图2 中药治疗脾肾阳虚型IBS-D关联规则网络图

表3 治疗脾肾阳虚型IBS-D前10味高频中药

表4 中药治疗脾肾阳虚型IBS-D关联规则

2.3 靶点收集 数据挖掘显示脾虚湿盛型核心配伍或为白术、甘草、党参、茯苓，脾肾阳虚型或为补骨脂、吴茱萸、肉豆蔻，利用TCMSP、ETCM数据库对以上中药进行活性成分和靶点收集。见表5。检索DisGeNET、GeneCards、OMIM数据库中IBS-D的相关靶点，去重后共收集到靶点554个。

表5 中药有效活性成分和靶点数

2.4 交集靶点 统计两个证型对应中药与疾病IBS-D的交集靶点，结果显示白术、甘草、茯苓、党参与IBS-D交集靶点tar-one共78个，补骨脂、吴茱萸、肉豆蔻与IBS-D交集靶点tar-two共80个， 对tar-one和tar-two的交集靶点进行统计，得到tar-common靶点54个。见图3。应用Cytoscape 3.9.0软件制作中药成分-疾病靶点图，并进行拓扑分析。见图4～5。

图3 tar-one和tar-two交集靶点

图4 tar-one中药成分-疾病靶点可视化

图5 tar-two中药成分-疾病靶点可视化

图4为白术、茯苓、甘草、党参4味药对IBS-D的中药成分-疾病靶点网络图。浅红色三角形为共有靶点tar-common，蓝色v形为除外共有靶点的其他靶点，黄色圆形为茯苓的有效成分，红色圆形为白术的有效成分，紫色圆形为党参的有效成分，绿色圆形为甘草的有效成分。图5为吴茱萸、补骨脂、肉豆蔻三味药对IBS-D的中药成分-疾病靶点网络图，浅红色三角形为靶点tar-common，紫色v形为除外共有靶点的其他靶点，绿色圆形为补骨脂有效成分，蓝色圆形为肉豆蔻有效成分，黄色圆形为吴茱萸有效成分。结合两图可发现，药物治疗IBS-D的关键靶点或为tar-one和tar-two交集靶点，即tar-common。

拓扑分析显示，白术中3β-乙酰氧基苍术酮（3β-acetoxyatractylone）， 甘草中槲皮素（quercetin），茯苓中常春藤皂苷元（hederagenin），党参中木犀草素（luteolin），补骨脂中二十四烷酸（lignoceric acid），肉豆蔻中β-谷甾醇 （β-sitosterol），吴茱萸中槲皮素（quercetin）为药物治疗IBS-D的核心成分。

2.5 PPI结果可视化分析 分别将tar-one、tar-two、tar-common导入STRING数据库，应用Cytoscape 3.9.0软件将得到的结果进行可视化分析，按节点度值（degree）排序，节点越大、颜色越深表明度值越高。见图6～8。 由图可知，tar-one、tar-two中的关键靶点与tar-common相似，主要为细胞肿瘤抗原p53（tumor protein p53，TP53）、肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF）、 血管内皮生长因子A（vascular endothelial growth factor A，VEGFA）、白介素-1B（interleukin-1B，IL-1B）、白介素-6（interleukin-6，IL-6）。

图6 tar-one PPI网络

图7 tar-two PPI网络

图8 tar-common PPI网络

2.6 GO和KEGG富集分析 将tar-one、tar-two、tarcommon导入DAVID数据库，进行GO和KEGG富集分析，设P≤0.05，GO富集分析中得到生物过程（biological process，BP） 条目tar-one共277条，tar-two共293条，tar-common共271条；KEGG分析结果tar-one共83条，tar-two共81条，tar-common共76条。对三组结果进行交集分析，发现按P值排列，tar-common中有228条GO分析和69条KEGG分析的条目均存在于tar-one和tar-two中。 见图9～10。 对tar-common中GO分析及KEGG分析的前20条结果以及tar-one、tar-two的非交集部分进行可视化分析，其中非交集部分的GO富集分析条目较多，只取前10条。见图11～12。

图9 tar-one、tar-two和tar-common的GO交集分析

图10 tar-one、tar-two和tar-common的KEGG交集分析

图11 GO富集分析

图12 KEGG富集分析

tar-common中GO富集分析主要为基因表达、转录调控、信号转导、免疫反应、炎症反应、细胞对脂多糖的反应、一氧化氮生物合成过程等。tar-common中KEGG通路富集分析主要为癌症途径、癌症中蛋白聚糖、胰腺癌、膀胱癌、甲型流感、南美锥虫病（美洲锥虫病）、利什曼病、弓形虫病、结核、丙型肝炎、乙型肝炎、炎症性肠病、类风湿关节炎、疟疾、阿米巴病、细胞因子-细胞因子受体相互作用、Toll样受体（Toll-like receptors，TLR）信号通路、缺氧诱导因子-1（hypoxia-inducible factor-1，HIF-1）信号通路、T细胞受体信号通路、NOD样受体（NOD-like receptors，NLR）信号通路等。

tar-one中GO分析的非交集条目主要与γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA）信号通路、激活磷脂酶C的G蛋白偶联乙酰胆碱受体信号通路、腺苷酸环化酶抑制G蛋白偶联乙酰胆碱受体信号通路、G蛋白偶联乙酰胆碱受体信号通路、离子跨膜转运、氯化物的运输转运、胆固醇代谢、平滑肌收缩正向调节等通路有关。KEGG分析包括逆行内源性大麻素信号、神经活性配体-受体相互作用、吗啡成瘾、尼古丁成瘾、GABA能突触、药物代谢-细胞色素P450、脂肪细胞因子信号通路、胆碱能突触、肾细胞癌、甲状腺癌、细胞色素P450对异生素的代谢等。

tar-two中GO分析为疼痛的感官知觉、IL-6产生的负调节、IL-10产生的正向调节、对革兰阴性菌的防御反应、平滑肌收缩的调节、血管收缩的调节、皮质肌动蛋白细胞骨架组织、细胞外调节蛋白激酶1（extracellular regulated protein kinases 1，ERK1）和ERK2级联的调节、黏膜的先天免疫反应等。KEGG分析为醛固酮调节的钠重吸收、胰岛素分泌、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）信号通路、环鸟苷酸-蛋白激酶G（cyclicguanosine-protein kinase G，cGMP-PKG）信号通路、 p53信号通路、催乳素信号通路、自然杀伤细胞介导的细胞毒性、EB病毒感染、胃酸分泌等。

3 讨论

IBS是一种在全世界广泛分布的疾病，研究表明全球IBS患病率约为11.2%[5]，其中IBS-D是一种重要亚型。目前认为，IBS发病与胃肠动力异常、内脏高敏感、脑肠轴调节异常、肠道菌群紊乱、肠道低度炎症等有关，以对症治疗为主，如止泻剂、益生菌等[1]。中医认为该病涉及多个脏腑，脾胃虚弱或肝失疏泄是其重要病机[4]，从五脏辨证进行治疗，常能取得不错疗效[6]。

本文对脾虚湿盛和脾肾阳虚两证型进行数据挖掘分析，发现脾虚湿盛型的前10味高频药物为白术、甘草、茯苓、党参、薏苡仁、陈皮、山药、白芍、砂仁、白扁豆，大多为益气健脾祛湿之药，且前4味药白术、甘草、茯苓、党参为四君子汤的基本组成。关联规则结果亦显示这四味药关联性强，考虑为中药治疗脾虚湿盛型IBS-D的核心配伍。四君子汤是补气健脾的经典方，白术健脾益气、燥湿利水，党参补脾益肺、养血生津，茯苓利水渗湿、健脾宁心安神，甘草甘平、炙用甘温，有补脾益气、缓急止痛、调和诸药之效。网络药理结果显示，白术中3β-乙酰氧基苍术酮，甘草中槲皮素，茯苓中常春藤皂苷元，党参中木犀草素为中药治疗IBS-D的重要成分。苍术酮是白术挥发油中一种重要成分，其性质不稳定，易于转化，产物如白术内酯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ等有抗炎、促进胃肠运动等作用[7]。刘丽娜等[8]发现，槲皮素可减轻IBS模型大鼠结肠黏膜炎症，增强肠屏障功能，改善内脏敏感性。另有研究显示，常春藤皂苷元、木犀草素有抗炎、抗菌、抗抑郁等作用[9-11]。

脾肾阳虚型IBS-D的高频药物前10味为白术、补骨脂、肉豆蔻、茯苓、甘草、党参、吴茱萸、白芍、五味子、山药。补骨脂、吴茱萸、肉豆蔻、五味子为四神丸的基本组成，善温脾暖肾、涩肠止泻。白术、甘草、茯苓、党参组成四君子汤，白芍柔肝止痛，山药健脾祛湿。关联规则分析表明，吴茱萸、肉豆蔻、补骨脂或为核心配伍，且常加党参、白术等健脾益气之药增强疗效。由此可知，临床上治疗脾肾阳虚型IBS-D时或以温补脾肾为基础，辨证加予健脾益气、柔肝祛湿等药，这与IBS-D病机相符。魏良兵等[12]发现，补骨脂-肉豆蔻对IBS有治疗作用，能调节结肠组织中促肾上腺皮质激素释放因子-环磷腺苷效应元件结合蛋白信号通路，降低内脏高敏感性。本研究显示，补骨脂中二十四烷酸、肉豆蔻中β-谷甾醇、吴茱萸中槲皮素或为治疗IBS-D的核心成分。研究显示，β-谷甾醇有抗炎抗菌等作用[13]。有关上述化合物对IBS-D影响的文献研究尚不多见，尚需进一步实验支持。

PPI网络显示，IL-6、TP53、TNF、VEGFA、IL-1B为中药治疗IBS-D关键靶点。IL-6、TNF、IL-1B是促炎细胞因子，与IBS-D发病机制有一定联系。Seyedmirzaee等[14]对74名IBS患者和75名健康者进行血清细胞因子比对，发现IBS患者血清中IL-6、TNF-α较健康者高。一项荟萃分析显示，IBS患者IL-6水平高于对照组，且在IBS-D中更显著[15]。另有研究发现，IL-1B能够诱导肠道通透性增加，导致肠道炎症的发生[16]。低度肠道炎症是IBS发病机制之一，可能与肠道菌群紊乱，产生毒素刺激肠黏膜，导致炎症因子生成有关。

tar-common的GO和KEGG富集分析显示白术、茯苓、党参、白术、补骨脂、吴茱萸、肉豆蔻7味中药参与基因表达、转录调控、信号转导、免疫反应、炎症反应、细胞对脂多糖的反应、一氧化氮生物合成过程的正调控等多项途径，并通过多种疾病通路、信号通路发挥治疗作用。研究表明，一氧化氮参与多种信号传导，具有调节胃动力的作用[17]，并与内脏超敏反应相关[18]。脂多糖会诱发肠道炎症和内脏高敏感性，富含可发酵寡糖、二糖、单糖和多元醇的食物可通过这一途径加剧IBS-D的症状[19-20]。TLR信号通路与炎症因子表达有关，通过影响肠道通透性，介导IBS-D炎症反应[21-23]。

tar-one的GO和KEGG分析显示，四君子汤还可以通过GABA通路、激活或抑制G蛋白偶联乙酰胆碱受体信号通路、离子跨膜转运、氯化物的运输转运、平滑肌收缩正向调节等途径发挥治疗作用，并与多种疾病通路、信号通路、代谢通路、突触通路密切相关。GABA、乙酰胆碱受体（acetylcholine receptor，Ach）为重要的中枢神经递质，能够通过脑肠轴完成肠-脑信号双向交流，调节IBS-D症状。GABA是中枢神经系统中重要的抑制性神经递质，肠神经细胞通过钠-钾-氯化物转运体增高细胞内氯化物浓度，从而激活肠神经系统中GABA受体[24]。胃肠道的GABA受体可调节胃肠道的分泌与运动，影响内脏高敏性感[25]；并能通过改变促炎因子的表达，起到抗炎作用[26]。Ach是一种重要的兴奋性神经递质，研究显示IBS患者结肠黏膜中的肥大细胞数量有所增加，其可激活肌肠神经元，通过释放Ach，调控平滑肌收缩[27]。

tar-two的GO和KEGG分析显示，补骨脂、肉豆蔻、吴茱萸治疗IBS-D与疼痛的感官知觉、炎症因子的表达、平滑肌收缩、血管收缩、免疫反应等生物过程有关，还有醛固酮调节的钠重吸收、胰岛素分泌以及多种信号通路参与。醛固酮主要作用于肾脏，通过促进肾脏对钠的重吸收来维持水钠平衡，Xiong等[28]研究表明补骨脂、肉豆蔻可通过调控钠/氢交换因子3重组蛋白来维持水、电解质稳态，抑制腹泻的发生。胰岛素分泌与糖尿病密切相联，中医常从脾对其进行论治[29]。有研究表明，IBS可能是糖尿病发病的一项高危因素[30]，且患有代谢性脂肪性肝病的糖尿病患者更易患IBS[31]。笔者推测，IBS-D尤其是脾肾阳虚型IBS-D与胰岛素分泌有一定联系，但具体机制还需进一步研究。

综上可知，脾虚湿盛型与脾肾阳虚型虽皆为虚证，但前者阳气微耗，尚以气虚为主，其型经久不愈，耗损脾阳，累及肾阳，导致脾肾两虚，渐以阳虚为导向。数据挖掘分析显示，中药治疗脾虚湿盛型IBS-D的关键为健脾益气，核心方药为四君子汤；治疗脾肾阳虚型IBS-D则在温阳的同时顾护脾气，核心方药为四君子汤合四神丸加减。网络药理学分析表明，脾虚湿盛型和脾肾阳虚型的两组核心药物在治疗靶点、通路上多有相似，都具有“多成分、多靶点、多通路”的特点，且作用机制大都与炎症反应的调节有关。四君子汤治疗脾虚湿盛型IBS-D还与脑肠轴中相关神经递质的释放有关，补骨脂、肉豆蔻、吴茱萸三药治疗脾肾阳虚型IBS-D还涉及到胰岛素分泌、醛固酮调节的钠重吸收等信号通路。