扬辐麦系列新品系赤霉病抗性鉴定与评价

刘建凤， 何震天， 张 容， 王建华， 韩 燕， 范德佳， 王汝琴， 陈士强

(江苏里下河地区农业科学研究所，江苏扬州 225007)

小麦赤霉病(Fusarium head blight，简称FHB)是一种世界范围内常见的小麦病害，也是我国小麦生产上的严重病害之一。小麦赤霉病一般发生年份可减产10%～30%，严重发生年份损失可达80%，局部甚至颗粒无收。小麦赤霉病发生以扬花期侵染为主，在连续阴雨且气温在15 ℃以上时，赤霉菌侵染小麦穗部小花，在籽粒灌浆成熟过程中沿穗轴迅速扩展，并在小麦籽粒中产生和积聚多种毒素，造成小麦严重减产、品质降低及食品安全问题。小麦赤霉病的流行主要受田间菌源量、扬花期气温和降水情况以及主栽品种赤霉病抗性等多个因素影响。近年来，受全球气候变化、轮作制度的增加、秸秆全量还田不到位和赤霉病菌对药剂的抗性上升等多种影响，小麦赤霉病的防控日趋严峻。到目前为止，赤霉病仍然是可防不可治，一旦发病将无法控制，只能采取预防措施。采用栽培措施和药剂防治方法虽取得了一定的防治效果，但均未能从根本上解决小麦赤霉病危害，尤其抽穗期喷洒农药后会造成麦粒的药残和环境污染，也与绿色生产相违背。因此，开展抗赤霉病育种，从根本上控制赤霉病的危害，对确保小麦安全生产意义重大。

众多研究表明，小麦赤霉病抗性主要分为抗侵染(typeⅠ)、抗扩展(typeⅡ)、抗DON积累(typeⅢ)、籽粒抗性(typeⅣ)等多种类型，且赤霉病抗性为多基因控制的数量遗传性状。目前已从普通小麦及其近缘种属中鉴定出250多个抗赤霉病QTL，但仅有7个主效抗赤霉病基因得到精准定位，即～，其中、、、、是抗扩展类型，、是抗侵染类型。是目前抗性最稳定、最强、应用最广泛的抗赤霉病基因，可以显著降低赤霉病严重度和减轻毒素积聚。李楠楠等对周麦品种(系)材料进行基因分子检测的结果显示，携带基因和不携带基因材料之间赤霉病抗性差异极显著，表明基因分子标记可用于改良周麦品种的赤霉病抗性。张宏军等对中抗赤霉病且具有基因的品种与高感赤霉病的矮败周麦16杂交和回交的后代进行基因功能标记选择，研究表明携带的后代家系整体抗性达到中感水平。由此可见，近年来科研和育种单位抗赤霉病育种的力度不断加强。

辐射诱变育种是创制和丰富小麦种质资源的有效途径，对提高小麦产量、增强抗性、改善品质等方面均具有重要的意义。我国在利用辐射诱变或杂交与辐射诱变相结合方式选育耐赤霉病品种方面取得了很多成果，宁麦3号是江苏省农业科学院1968年利用辐射诱变育成的耐赤霉病的小麦品种，用它作为抗性亲本，获得了多个耐赤霉病的“宁麦”系列品种；扬麦158是江苏里下河地区农业科学研究所1993年通过杂交与辐射诱变相结合的方法育成的高产中抗赤霉病且农艺性状优良的小麦品种，该品种是长江中下游地区历史上种植面积和覆盖率最大的小麦品种之一。扬辐麦是江苏里下河地区农业科学研究所通过辐射诱变或杂交与辐射诱变相结合方式选育的系列小麦品种(系)，先后育成15个小麦品种，其中2008年育成的超高产小麦扬辐麦4号先后作为农业农村部主体品种、江苏省主推品种、江苏好品种，推广应用近133.33万hm，种植面积一直处于江苏淮南麦区小麦品种前列。

明确近年来培育的扬辐麦系列新品系的赤霉病抗性水平，是筛选和鉴定集高产多抗于一体的扬辐麦系列新品种(系)的关键。本研究通过人工接种方法对扬辐麦新品系进行赤霉病抗性鉴定，同时利用抗赤霉病主效基因紧密连锁的分子标记对抗性较好的品系进行分子检测，以期筛选出抗性较好的目标品系，加速扬辐麦的抗赤霉病育种，同时也为开展抗性基因定位与克隆研究提供可利用的抗病种质资源。

1 材料与方法

1.1 试验材料

本研究以341个扬辐麦系列中间品系为试验材料，选用赤霉病不同抗性水平的苏麦3号、扬麦158、扬麦15、安农8455作为抗病、中抗、中感、感病对照，由江苏里下河地区农业科学研究所提供。

供试禾谷镰刀菌菌液及病麦粒由江苏省农业科学院植物保护研究所陈怀谷研究员及江苏里下河地区农业科学研究所张勇研究员提供，包括F0301、F0609、F0980、F1126等4种高致病力赤霉菌株。

1.2 试验设计

试验材料于2020年秋播时种植于江苏里下河地区农业科学研究所万福基地试验田，在小麦赤霉病土表接种鉴定圃和单花滴注接种鉴定圃各种植1套。试验田人工开沟，每份材料种植2行，行长 1 m，行距25 cm，株距5 cm，每隔50个试验材料设对照品种，病圃土壤肥力中等，前茬为水稻，鉴定圃的管理措施如施肥、除草、害虫防治等同常规育种田。

1.3 赤霉病抗性鉴定与评价

接种方法：参考张彬等的方法，用供试的小麦赤霉病混合菌种病麦粒和孢子悬浮液对供试品种分别进行土表接种和单花滴注接种。土表接种是将病麦粒于小麦抽穗前1个月(2021年3月11日)均匀撒于鉴定圃，接种量为4 kg/667 m，接种后定期采用自动弥雾喷水装置保持土壤水分，利于子囊壳形成，诱导发病；单花滴注接种法于试验材料扬花初期(2021年4月8—15日)，用注射器吸取 5 μL 孢子悬浮液注入麦穗自上而下第5小穗的任意1个小花中，孢子悬浮液的浓度为10倍×10倍显微镜视野下约30个游离孢子，每个材料接种20个单穗，接种后设立自动弥雾喷水装置人工保湿，喷雾3～4次/d，每次5 min左右，保证田间湿度利于病害的发生。

抗性评价方法：在小麦乳熟中后期，以苏麦3号为抗病对照，扬麦158为中抗对照，扬麦15为中感对照，安农8455为感病对照，参照中华人民共和国农业行业标准NY/T 2954—2016《小麦区域试验品种抗赤霉病鉴定技术规程》和张晓军等的方法调查和记载各试验材料的发病程度，每份材料随机抽取15个麦穗。(1)土表接种，待病情发展基本稳定时，调查其病情严重度级别。分级标准：0级，无发病小穗；1级，发病小穗占全穗1/4以下；2级，发病小穗占全穗1/4～1/2；3级，发病小穗占全穗1/2～3/4；4级，发病小穗占全穗3/4以上。计算病穗率和病情指数()：病穗率=发病穗数/总调查穗数×100%；病情指数()=∑(各病级穗数×相应病级数)/(最高病级数×总调查穗数)×100。(2)单花滴注接种，接种25 d后开始调查接种穗的病情严重度及病小穗数。分级标准：0级，接种小穗无可见发病症状；1级，仅接种小穗或相邻的个别小穗发病，穗轴不发病；2级，穗轴发病，发病小穗占全穗1/4以下；3级，穗轴发病，发病小穗占全穗 1/4～1/2；4级，穗轴发病，发病小穗占全穗1/2以上。计算各品系的严重度和病小穗率(percentage of diseased spikelet，简称PDS)：平均严重度()=∑(各病级穗数×相应病级数)/总调查穗数；病小穗率()=病小穗数/总小穗数×100%。抗性评价以对照品种为基准，划分为免疫(I)、抗(R)、中抗(MR)、中感(MS)、感(S)品种。考虑基因型和环境综合影响，参照对照品种的表现进行抗性分级，评价标准见表1。

表1 小麦赤霉病抗性划分标准

1.4 Fhb1基因的检测

对经单花滴注接种鉴定为中抗赤霉病的品系，于其幼苗期，采集新鲜嫩叶片1 g左右，采用北京索莱宝科技有限公司提供的植物基因组DNA提取试剂盒提取叶片基因组DNA，具体操作步骤参考说明书。采用引物TaHRC-F/TaHRC-R进行基因鉴定，引物序列为TaHRC-F：5′-A T T C C T A C T A G C C G C C T G G T-3′，TaHRC-R：5′-G C C A A T C A G G T T C T G A G G C A T T T T A-3′。利用南京诺唯赞生物科技有限公司的GreenMix进行PCR扩增，PCR体系总体积为10 μL，其中GreenMix为5 μL，正反向引物各1 μL，DNA为0.5 μL，ddHO补足至 10 μL。引物PCR的具体程序：94 ℃预变性 3 min；94 ℃变性15 s，64 ℃退火15 s，72 ℃延伸 30 s，30个循环；72 ℃延伸5 min。最终用1.0%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，抗病材料扩增片段大小为 1.4 kb，感病材料扩增片段大小为2 kb，以苏麦3号为阳性对照，将位点呈抗病基因型的品种记为“*”。

1.5 数据分析

利用Microsoft Excel 2007对试验数据进行数据统计分析。

2 结果与分析

2.1 扬辐麦新品系的赤霉病抗性

由表2可知，土表接种条件下，抗病对照品种苏麦3号病穗率均值为17%，中抗对照品种扬麦158病穗率均值为53%，中感对照品种扬麦15的病穗率均值为66%，感病对照品种安农8455的病穗率均值为78%；单花滴注条件下，抗病对照品种苏麦3号严重度均值为1.37，中抗对照品种扬麦158严重度均值为2.01，中感对照品种扬麦15的严重度均值为3.11，感病对照品种安农8455的严重度均值为3.82，说明本年度扬辐麦新品系的抗性鉴定均为有效试验。

表2 人工接种条件下对照品种的赤霉病试验结果

由表3可知，采用土表接种法鉴定，341个扬辐麦新品系材料中，没有筛选到对赤霉病抗病(R)的品系，表现中抗(MR)的品系有69个，占供试品系的20.2%；中感(MS)的品系248个，占供试品系的72.7%；感病(S)的品系24个，占供试品系的7.1%。采用单花滴注接种鉴定，341个扬辐麦新品系材料中，没有筛选到对赤霉病扩展抗病(R)的品系，表现中抗(MR)的品系有49个，占供试品系总数的14.4%；中感(MS)的品系241个，占供试品系总数的70.6%；感病(S)的品系51个，占供试品系总数的15.0%。鉴定结果表明，土表接种和单花滴注接种都没有鉴定到赤霉病抗性达R的扬辐麦新品系，达MR的品系有14.4%～20.2%，达MS的品系70.6%～72.7%，可见MS以上的品系占比85.0%～92.9%，表明扬辐麦新品系对赤霉病抗性水平较好。

表3 扬辐麦新品系的赤霉病抗性水平

2.2 Fhb1基因的分子标记检测结果

对49个经单花滴注接种鉴定为中抗赤霉病的小麦品系，进行赤霉病抗性基因的标记诊断鉴定，部分PCR产物的电泳结果见图1。对结果进行统计发现，抗病对照苏麦3号、7个扬辐麦新品系携有基因，中抗对照扬麦158、中感对照扬麦15、感病对照安农8455及其他42个扬辐麦新品系未检测到基因(表4)。7个携基因品系的病小穗率在15.1%～17.1%，严重度在1.8～2.0，与中抗对照扬麦158病小穗率(20.4%)及严重度(2.01)差异明显。由此可见，携基因扬辐麦新品系的赤霉病抗性水平明显高于中抗对照品种扬麦158。

表4 经单花滴注接种鉴定为MR品系Fhb1基因的检测结果

3 讨论与结论

近年来，随着气候、环境、耕作方式等变化，小麦赤霉病的流行速度与危害程度不断增加。江苏省地处黄淮海地区，在小麦生长期常高温多雨，在温湿环境下，极易暴发小麦赤霉病，一旦暴发不仅会影响小麦的产量，且产生和累积多种毒素，导致小麦品质降低，造成食品安全问题，危害人畜健康。鉴于此，江苏省小麦品种审定时对赤霉病抗性提出了更高的要求，淮南麦区的小麦品种必须对赤霉病达到中抗及以上才能进行品种审定，否则小麦品种审定中一票否决。可见，选育和推广适合该麦区种植的赤霉病抗性小麦品种尤为重要。

小麦赤霉病抗感表型的准确鉴定对资源的表型评价、基因精细定位和克隆、抗性机制解析研究及培育抗病品种等非常关键。土表接种和单花滴注接种是表型鉴定小麦赤霉病抗性最常用的方法，张煜等采用土表接种结合单花滴注接种的方法对黄淮南部762个小麦品种(系)的赤霉病抗性进行鉴定，筛选出10个稳定的中抗赤霉病小麦品种(系)。张彬等采用土表接种和单花滴注接种对黄淮南片麦区的65个主栽小麦品种进行了赤霉病抗性鉴定，发现黄淮南片主栽小麦品种的赤霉病抗性普遍较差。本研究采用土表接种和单花滴注接种对341个经过辐射诱变技术育成的新品系分别进行赤霉病抗性鉴定，土表接种鉴定发现69个品系表现为中抗赤霉病，单花滴注接种鉴定发现49个品系表现为中抗赤霉病，且有7个品系含有基因，这为小麦抗赤霉病育种提供了重要的遗传材料。

小麦赤霉病是由多基因控制的数量性状，遗传机制复杂，如何减小菌源多寡及温湿度等环境因素的影响，实现准确鉴定比较困难。为了提高赤霉病鉴定的准确性，将人工接种与自然感病调查相结合，对高世代的品系可连续多年和安排到异地穿梭进行多点鉴定，再结合分子标记技术辅助进行选择。从笔者所在课题组对小麦赤霉病抗性鉴定多年的结果看，抗性较好的小麦材料，往往植株较高、麦穗较长、小穗密度较低、小穗数较少、籽粒较小，这些性状于小麦的丰产相悖。因此，在小麦抗赤霉病育种及抗性种质创制中，可通过辐射诱变或杂交与辐射诱变相结合，采用田间和人工赤霉病抗性筛选、分子标记辅助选择及农艺性状选择的三者有机结合，培育产量性状优良的抗性品种。

本研究的鉴定结果表明，经过辐射诱变或杂交与辐射诱变相结合育种技术选育的341个新品系中，没有品系达到R级赤霉病抗性，说明 R级的小麦品系极其稀少，与相关研究的结果一致。土表接种鉴定抗性达到MR级的品系有69个，占试验材料的20.2%；单花滴注接种鉴定抗性达到MR级的品系有49个，占试验材料的14.4%，其中有7个品系含有基因。由此可见，扬辐麦新品系对赤霉病抗性水平较好，可以尝试从这些MR级材料中筛选赤霉病抗性好的新种质，挖掘抗赤霉病其他基因，也可从中筛选出丰产性、综合性状好的品种。表明利用辐射诱变或杂交与辐射诱变相结合技术进行小麦育种，能够获得赤霉病抗性好的新种质、新材料，是小麦抗赤霉病育种中切实有效的选育方法。