基于网络药理学探究络石藤-牛膝药治疗关节炎的作用机制

庞婷，唐秋莲，陈勇，魏江存，梁草，王志强，何欢，曾超*

1.广西农业职业技术大学药学系，南宁 530007；2.广西中医药大学药学院，南宁 530022；3.广西国际壮医医院，南宁 530003；4.广西中医药大学第一附属医院，南宁530023

关节炎（Arthritis）指发生于人体关节及其周围组织的炎性疾病，临床表现为关节红、肿、热、痛、功能障碍及关节畸形。治疗药物包括非甾体抗炎药、类固醇皮质激素、生物制剂及中药等，藤类是使用最广的中药，包括络石藤、雷公藤、石南藤等。临床研究表明，黄芪、络石藤、川牛膝加减方治疗大动脉炎、四肢麻木及疼痛效果显著[1]，薏苡仁汤加减汤具温阳祛湿，活血通络之功效[2]。络石藤，主治风湿热痹、筋脉拘挛、腰膝酸痛以及跌打损伤等症[3]，为夹竹桃科植物络石藤Trachelospermum jasminoides（Lindl.）Lem.的干燥带叶藤茎，为关节炎等最常用药之一[4]，其中络石苷类等是含量较多且为抗风湿作用的可能活性代表成分[5,6]。牛膝，为苋科植物牛膝Achyranthes bidentata Bl.的干燥根，具有逐瘀通经、补肝肾、强筋骨等功效[7]。研究表明，牛膝对腰椎间盘突出症的作用机制可能是槲皮素、山柰酚、β-谷甾醇等活性成分通 过PI3K/Akt、TNF 和VEGF 等信号通路 对IL-6、EGFR、VEGFA、MAPK8 等相关靶点发挥作用[8,9]。

目前的研究多为单味络石藤或与多味中药配伍组方[9]，络石藤配伍药对治疗关节炎的研究甚少，其作用机制不明。“药对”，也称“对药”，是中药配伍的最小单元，为指导简化使用经典方剂、降低配伍毒性等提供了有力依据[10]。本实验从《江西本草》中记载的痹痛经方中优选“络石藤-牛膝”药对，以网络药理学数据库为基础，从有效成分、基因靶点、信号通路等方面初步探讨“络石藤-牛膝”药对治疗关节炎的作用机制。

1 资料与方法

1.1 检索获得研究资料

1.1.1 检索药对有效成分及靶基因 通过TCMSP 数据库（https://tcmspw.com/tcmsp.php）分别检索牛膝、络石藤的化合物成分。成分筛选条件设置为“OB≥30%，DL≥0.18”。将纳入的化合物成分通过TCMSP数据库进行成分的靶点预测，经汇总删重后得到关键有效成分及靶基因。

1.1.2 检索关节炎的相关靶点 以目标疾病“Arthritis”为关键词，在GeneCards 数据库（https://www.genecards.org/）、NCBI 基因数据库（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）以及OMIM 数据库（http://ctdbase.org/）进行人类基因检索。其中，GeneCards 数据库根据数据库中以score 进行中位值的筛选，获得更相关的靶点。然后将1.1.1 筛选出的药物靶点与疾病靶点输入韦恩图制作软件Venny 2.1，得到共同靶点。

1.2 构建网络

1.2.1 构建PPI 网络图 将1.1.2 获得的“药对-疾病”共有靶点输入STRING 数据库（https://string-db.org/cgi/input.pl），进行PPI 网络构建，将生物种类设定为“Homo sapiens”，置信度＞0.9，形成PPI 网络。然后将PPI 网络导入Cytoscape 3.8.0 中，通过Network Analyzer 工具进行拓扑分析，通过“degree”排序，选取分值大于平均分的基因作为关键靶点，确定药对“络石藤-牛膝”治疗关节炎的核心靶点共41 个；运用R 3.6.3 对前20 个靶点进行绘制，并设置横坐标为靶点的度值进行展示；将PPI 网络导入Cytoscape 3.6.0 中，打开MCODE 模块进行基因簇的分析以及核心靶点的筛选，共获得基因簇5 个和核心基因4 个。

1.2.2 基因本体论（GO）功能富集分析与基因组百科全书（KEGG）通路富集分析 将1.1.2“药物-疾病”共有靶点进行GO 功能的生物过程（biological process，BP）、分子功能（molecular function，MF）、细胞组分（cell component，CC）富集以及KEGG 通路的富集分析，引用STRING 网络数据库，设置校正“P≤0.05”进行筛选，探究靶点蛋白的作用机制，并使用R 3.6.3 软件，安装并引用cluster Profiler 包后进行气泡图绘制。

1.2.3 “络石藤-牛膝”药对“药材-成分-疾病-靶点-通路”网络构建 将“络石藤-牛膝”药对成分及关节炎、靶点及通路网络文件导入Cytoscape3.8.0 进行通路网络图的绘制，设置不同颜色以便更直观地展示中药活性成分在治疗关节炎过程中的多成分、多靶点的作用特点。

2 结果

2.1 药对络石藤-牛膝的有效成分、靶基因预测

通过TCMSP 数据库筛选成分及靶点，经汇总删重后，络石藤获得谷甾醇、豆甾醇等9 个化合物成分，PGR、NCOA2、ADH1C 等94 个靶点；牛膝获得黄连素、槲皮苷等21 个化合物成分，NR3C2、PTGS1、ESR1等205 个靶点。

2.2 Arthritis 相关靶点筛选

通过在GeneCards 数据库检索，获得1525 条相关基因，NCBI 数据库获 得1441 个基因，OMIM数据库获得45 个靶点。将这3 个数据库的基因合并、删重之后，得到2314 个Arthritis 相关基因。将筛选出的药物靶点与疾病靶点输入韦恩图制作软件Venny 2.1，共获得128 个（5.3%）共有靶点可作为药物作用于疾病的预测靶点。结果如图1 所示。

图1 关节炎与络石藤-牛膝药对相关靶点韦恩图Fig.1 Venny plots of the related targets of the Arthritis-herb-pair

2.3 药对络石藤-牛膝-靶点PPI 分析

通过STRING 数据库得到128 个共有靶点的蛋白互作网络，共480 条边，平均度值为7.5，结果如图2 所示。将PPI 网络通过NetworkAnalyzer 工具进行拓扑分析筛选出41 关键靶点，运用R 3.6.3 对前20 个靶点进行图片绘制展示，设置横坐标为靶点的度值，见图3。将PPI 网络导入Cytoscape3.6.0 中进行MCODE 聚类分析，得到5 个基因簇（表1）；4 个核心基因分别为ESR1，CXCL8，MAPK8，CTSD。

图2 关节炎-药对的STRING 数据库PPI 网络图Fig.2 PPI network diagram of STRING database for Arthritis-herb-pair

表1 MCODE 聚类分析详细信息表Tab.1 MCODE cluster analysis detailed information table

图3 “药对-关节炎”前20 共有靶点的拓扑分析结果图Fig.3 Topological analysis results of the top 20 common targets of "herb-pair -arthritis"

2.4 组分-疾病-靶点网络构建

为更好地理解成分、疾病以及相应靶点之间的相互作用关系，本实验以筛选出来的成分、疾病以及作用靶点为基础，构建“组分-疾病-靶点”网络图，导入Cytoscape 3.8.0 中进行绘制，如图4 所示。

图4 “药对组分-靶点-关节炎”网络图注：网络中淡紫色为活性成分，绿色为药物作用于疾病的靶点，橙色矩形为疾病Fig.4 Network diagram of“herb-pair component -targets -arthritis”Note: In the network,the active ingredients were in mauve,the targets of the drug on the disease were in green,and the diseases were in orange rectangle

2.5 关键成分筛选

将2.4 项下的“成分-疾病-靶点”网络图，再次导入Cytoscape 3.8.0 中进行拓扑分析。成分进行degree排序，degree 值越高，成分越显著。详见表2。

表2 关键成分信息表Tab.2 Key components information table

2.6 GO 功能富集分析与KEGG 通路富集分析

引用STRING 数据库并设置“P≤0.05”进行筛选，其中GO 功能富集得到2329 条生物过程，150 项分子功能相关，60 项细胞组成相关，见图5；KEGG 通路富集分析获得154 条信号通路，见图6。气泡图中，横坐标为GeneRatio，指该pathway 中富集到的差异基因个数与注释基因个数的比值，值越大，富集程度越大；气泡的颜色代表多重假设检验校正后的P 值，取值范围为[0～1]，颜色越红，越接近零，则富集越显著。

图5 GO 功能富集分析气泡图Fig.5 Bubble diagram of GO functional enrichment analysis

图6 KEGG 通路富集分析气泡图Fig.6 Bubble diagram of KEGG pathway enrichment analysis

2.7 “络石藤-牛膝”药对的“药对-成分-疾病-靶点-通路”网络构建

将2.1-2.6 项下的有效结果，通过Cytoscape 平台构建药对“络石藤-牛膝”治疗关节炎的“药对-成分-疾病-靶点-通路”网络图（图7）。

图7 “药对-成分-疾病-靶点-通路”网络图注：蓝色为组分，黄色为药对作用于疾病的靶点，绿色为最显著的前20 条通路，红色为关节炎Fig.7 “Pair herb-components-disease-targets-pathways”network diagramNote：The blue were the components,yellow were the targets of pair herb on the disease,green were the top 20 most significant pathways,red was arthritis

3 讨论

本实验从TCMSP 数据库中筛选到络石藤9 种有效成分，包括谷甾醇、豆甾醇、牛蒡子苷、去甲汉黄芩素、老刺木碱、伊博格碱、木樨草素等；牛膝21 种组分，包括黄连素、槲皮苷、β-脱皮甾酮、黄连碱、汉黄芩素、黄芩苷、黄藤素等。以“Arthritis”为关键词，在GeneCards 数据库、NCBI 数据库及OMIM 数据库获得2314 个不同的关节炎相关基因，通过Venny 作图，获得128 个疾病-药对共有靶点，包括PGR、PTGS1、PTGS2、SLC6A3、ADRB2、PLAU、LTA4H 等，占总靶点的5.3%。PGR 是反应腺体细胞功能状体、萎缩及病变的重要比值，在恶性病变等异常疾病过程中，相关指标可发生显著的变化[11]。“药对-关节炎”的拓扑分析结果显示，MAPK1、JUN、RELA、AKT1、IL6 的度值最大，关联性也最大；MCODE 聚类分析则显示，CXCL8 度值最大，其次是ESR1。CXCL8 与ESR 为关节炎标志物，参与血管损伤，会刺激和募集机体炎性因子释放[12]，而CXCL8 可参与传递信号，促进免疫调节表达，进一步加快其他炎性细胞因子的分泌[13]。本实验在进行“成分-疾病-靶点”网络图的二次拓扑分析时发现，槲皮苷的度值最大，高达89；木樨草素、山奈酚、汉黄芩素则在30 以上，可能性仅次于槲皮苷。研究表明，槲皮苷可通过下调COX-2/5-LO 活性，减少炎症介质的分泌从而达到抗类风湿性关节炎、降低毒性作用[14]；槲皮苷、山奈酚、汉黄芩素等有效组分均具有抗炎作用。木犀草素（LUT），存在于水果和蔬菜中，具有抗氧化炎性反应和细胞凋亡反应的药理活性，与阿霉素等具有肺毒性的药物合用可有效降低阿霉素在肺和造血系统中诱导的毒性[15]，可以通过AKT/mTOR 信号通路表观遗传调控MMP9 的表达，抑制雄激素受体阳性三阴性乳腺癌细胞的增殖和转移等[16]。至于络石藤-牛膝治疗关节炎的确切有效组分是槲皮苷还是木樨草素或山奈酚，抑或是多组分联合所致，有待进一步实验验证。

GO 功能富集分析集中细胞膜的PTGS2、SLC6A3、KDR、OPRM1 等靶点，细胞因子VEGFA、IL-10、TNFSF-15 等受体，脂多糖PTGS2、NOS2、OPRM1、RELA、AKT1 等靶基因。PTGS2 可将花生四烯酸转化为前列腺素H2（PGH2），介导生物碱、黄酮等通过VEGFA、IL-10、TNFSF15、AKT1 等通路，从而达到止咳平喘、抗炎作用[17,18]。KEGG 通路富集分析集中在AGE-RAGE 信号通路、IL-17 信号通路、TNF 信号通路等。AGEs-RAGE 可参与氧化应激反应，使ROS 的生成增加，从而激活下游JAK-STAT 信号通路，促进细胞增殖、分化[19]；还可以参与上调TNF-α、IL-6 等炎性介质的表达，参与炎性反应，是炎性反应的常见通路。

综上所述，药对“络石藤-牛膝”与关节炎靶基因的主要活性成分为槲皮苷、木樨草素、山奈酚、汉黄芩素等。药对“络石藤-牛膝”治疗关节炎的作用机制可能与核心基因ESR1，CXCL8，MAPK8，CTSD 表达的蛋白有关，与调节AGE-RAGE 信号通路、IL-17 信号通路、TNF 信号通路等有关，具体的活性组分、蛋白及通路，有待进一步验证。