生骨再造丸对兔激素性股骨头坏死骨形态计量学指标的影响

马学强，曹林忠, ，蒋玮，张琪，刘孟初，王多贤

1.甘肃中医药大学中医临床学院，兰州 730000；2.甘肃中医药大学附属医院骨科，兰州 730000

激素性股骨头坏死（steroid-induced osteonecrosis of the femoral head，SONFH）是骨科常见难治性疾病，在非创伤性因素引起的股骨头坏死中发病率逐年增高，约70%的患者须行髋关节置换手术治疗[1,2]。长期或大量使用糖皮质激素（Glucocorticoid，GC）能够导致股骨头组织形态发生严重改变，是股骨头坏死发生的关键环节。生理浓度的GC 可以促进骨髓间充质干细胞（bone mesenchymal stem cells，BMSCs）的成骨分化和骨形成，然而，高剂量GC 可抑制成骨细胞分化和骨形成，并将BMSCs 的分化从成骨细胞谱系转移到脂肪细胞谱系[3～5]。GC 能够诱导蛋白质合成减少、肠道钙吸收障碍并进一步减少骨转换。同时，GC 诱导的成骨细胞凋亡能够进一步导致股骨头骨量减少、骨小梁断裂、股骨头变形甚至坏死。股骨头内骨小梁生长障碍、结构破坏导致的骨量减少、骨质疏松、微骨折发生和髓腔内脂肪大量生成是SONFH 发生的主要病理特征。股骨头形态计量学指标的变化能够客观反映SONFH 的发展和预后情况[6]。仙灵骨葆胶囊具有“补肝肾、强筋骨”之功效，动物实验及临床研究均证实其对骨质疏松症、骨折、股骨头坏死、骨关节炎等疾病具有显著疗效，是临床治疗SONFH 的常用药[7]。生骨再造丸是甘肃中医药大学附属医院院内制剂，在临床中证实能够有效缓解SONFH 患者的症状，改善髋关节功能[8～10]。本研究以生骨再造丸对照仙灵骨葆胶囊对SONFH 兔模型进行治疗，探讨生骨再造丸对股骨头组织病理学和骨计量学的改善作用，为其临床应用推广提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 健康普通级3月龄新西兰大白兔20 只，体重2～2.5 kg，购于陕西君行生物科技有限公司，SCXK（陕）2017-001；喂养于中国人民解放军联勤保障部队九四〇医院实验动物中心，SYXK（军）2017-0046。饲养期间自由饮水，昼夜各半照明，湿度恒定，温度22～25 ℃，饲料购于斯贝福（北京）生物技术有限公司，SCXK（京）2019-0010。所有操作符合甘肃中医药大学实验动物伦理委员会要求。

1.1.2 实验药物与试剂 生骨再造丸（甘肃中医药大学附属医院，甘药制字Z20130012，批号：20210708），仙灵骨葆胶囊（国药集团同济堂（贵州）制药有限公司，国药准字Z20025337，批号：201127），大肠杆菌内毒 素（15600：M5，美 国 Wako公司，批 号：1001164401），甲泼尼龙琥珀酸钠注射液（美国Pfizer公司，国药准字H20030727，批号：20171507），青霉素钠（华北制药，国药准字H13024308，批号：F8122301）。

1.1.3 实验仪器和软件 Viva CT80 型微计算机断层扫描设备（Micro-CT）、μCT Evaluation Program V6.6三维重建分析软件（SCANCO MEDICAL AG 公司，瑞士），BH-2 型光学显微镜（Olympus 公司，日本），PANNORAMIC DESK/MIDI/250/1000 全景切片扫描仪、CaseViewer2.4 扫描浏览软件（3DHISTECH 公司，匈牙利）。

1.2 实验方法

1.2.1 造模及分组 新西兰兔适应性喂养7 d，采用随机数字表法分为正常组、模型组、生骨再造丸组、仙灵骨葆胶囊组各5 只，均予标准化饮食，不限制活动。模型组、生骨再造丸组和仙灵骨葆胶囊组采用大肠杆菌内毒素联合甲泼尼龙琥珀酸钠造模：兔耳缘静脉注射大肠杆菌内毒素（10 μg/kg），24 h 后再给药1 次；在第2 次注射内毒素后，立刻臀肌注射甲泼尼龙琥珀酸钠注射液（25 mg/kg），每隔24 h 注射1 次，共3 次。正常组同时臀肌注射生理盐水（10 mg/kg）。注射激素的新西兰兔同时预防性注射青霉素钠，80 万单位/次，2 次/7 d。根据Meeh-Rubner 氏体表面积换算公式计算兔用药量：A（m2）=K×W（g）2/3 ÷ 1000，兔系数K取10.1，按成人体重65 kg 需生骨再造丸和仙灵骨葆胶囊分别为4.5 g/d 和3.0 g/d 换算，兔所需等效生骨再造丸药量为2.4 g·kg-1·d-1，仙灵骨葆胶囊药量为0.4 g·kg-1·d-1。清晨按各组及不同体重计算剂量，生骨再造丸组用2.4 g/kg 生骨再造丸灌胃，仙灵骨葆胶囊组用0.4 g/kg 仙灵骨葆胶囊灌胃，空白组和模型组用10 mL生理盐水灌胃。1次/d，连续给药28 d后取材观察。

1.2.2 股骨头组织病理学观察 各组兔股骨头标本置于10%的EDTA-2Na 溶液中脱钙，梯度乙醇脱水，常规石蜡包埋、切片，切片厚度为4 μm，进行HE 染色，光学显微镜下观察组织病理学变化。

1.2.3 股骨头空骨陷窝率分析 使用PANNORAMIC全景切片扫描仪将组织切片进行扫描，用CaseViewer2.2 软件打开后可以1～400 倍放大观察，选取组织的目的区域进行400 倍成像。成像完成后使用Image-Pro Plus 6.0 软件分析计数每张切片空骨陷窝数、总骨陷窝数，计算空骨陷窝率（空骨陷窝数/骨陷窝数×100%）。

1.2.4 股骨头micro-CT 扫描重建和骨计量学参数分析 取兔股骨头，置于4%多聚甲醛溶液中固定48 h，采用Micro-CT 对标本进行扫描，扫描参数如下：二值化阈值20～80，电压55 kVp，电流133 μA，兴趣区域1 cm×1 cm×1 cm；用μCT Evaluation Program V6.6 软件进行三维重建，并进行骨体积分数（bone volume/tissue volume，BV/TV）、骨小梁数量（trabecular number，Tb.N）、骨小梁厚度（trabecular thickness，Tb.Th）、骨小梁分离度（trabecular separation，Tb.Sp）、结构模式指数（structure model index，SMI）和骨小梁连接密度（connectivity density，Conn.D）等骨计量学参数分析。

1.3 统计学分析

应用SPSS 25.0 软件对实验所得数据进行统计分析，所有数据以均数±标准差（）表示，符合正态分布，计量资料组间比较采用单因素方差分析，定性资料比较采用χ2检验，P＜0.05 为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 生骨再造丸对SONFH 兔股骨头影像学改变的影响

Micro-CT 扫描二维、三维重建显示：正常组股骨头外形完整，骨小梁结构致密、粗细均匀，骺板上区域骨质较多；模型组股骨头骨小梁结构明显疏松，间隙变宽，粗细不均，凹凸不平，局部骨骺轻微变形，骺板上区域骨质减少；生骨再造丸组骨小梁结构较模型组致密、增粗，股骨头外形较完整，骺板上区域骨质增无明显减少；仙灵骨葆胶囊组股骨头外形较完整，骨小梁结构较致密，较模型组增粗，骺板上区域骨质增多(图1)。

图1 兔股骨头Micro-CT 扫描重建二维、三维图像A1～D1：冠状面三维图像A2～D2：横截面二维图像 A：正常组B：模型组C：生骨再造丸组D：仙灵骨葆胶囊组Fig.1 2D and 3D images reconstructed by Micro-CT scanning of femoral head of rabbits in different groupA1～D1: 3D recostruction of coronal plane;A2～D2: 2D image of cross section A: Normal group; B: Model group; C: Shenggu Zaizao pill group; D:Xianling Gubao capsule group

2.2 股骨头骨计量学参数分析

与正常组比较，模型组BMD、BV/TV、Tb.N、Tb.Th 和Conn.D 均显著降低，而Tb.Sp 和SMI 显著升高，差异具有统计学意义（P＜0.05）；与模型组比较，生骨再造丸组和仙灵骨葆胶囊组BMD、BV/TV、Tb.N、Tb.Th 和Conn.D 均显著升高，Tb.Sp 和SMI 降低，差异具有统计学意义（P＜0.05)，生骨再造丸组和仙灵骨葆胶囊组疗效无显著差异（P＞0.05），见图2。

2.3 组织形态病理学改变

HE 染色观察，正常组骨骺厚度均匀；骨小梁分布密集，骨骺处不断新生松质骨，骨陷窝丰富，表面覆盖成骨细胞；骨髓腔造血细胞丰富。模型组局部骨骺变形，轻微增厚，凹凸不平；骨小梁增生，分布较稀疏，骨骺处新生松质骨，可见骨陷窝，表面覆盖成骨细胞；骨髓腔可见造血细胞和多量脂肪细胞；骨骺端骨小梁减少。生骨再造丸组组织结构较清晰；骨骺厚度较均匀，软骨细胞排列较整齐；可见较丰富的骨小梁，呈条状、分枝状等，骨陷窝较丰富，表面覆盖成骨细胞；骨髓腔可见较丰富的造血细胞和少量脂肪细胞。仙灵骨葆胶囊组组织结构较清晰；骨骺厚度较均匀，软骨细胞排列较整齐，骨骺处少量新生松质骨；可见较丰富的骨小梁，呈条状、分枝状等，较丰富的骨陷窝，表面覆盖成骨细胞；骨髓腔可见较丰富的造血细胞，见图3。

图3 兔股骨头病理切片组织形态A：正常组 骨小梁密集，骨骺新生松质骨（蓝色箭头），骨陷窝丰富，表面覆盖成骨细胞；骨髓腔丰富的造血细胞B：模型组 局部骨骺变形（红色箭头），轻微增厚，凹凸不平；骨小梁增生，分布较稀疏，骨骺处新生松质骨（蓝色箭头），可见骨陷窝，表面覆盖成骨细胞；骨髓腔较多的造血细胞和多量脂肪细胞（黑色箭头）；骨骺端骨小梁减少（绿色箭头）C：生骨再造丸组组织结构较清晰；骨骺厚度较均匀（绿色箭头），软骨细胞排列较整齐；较丰富的骨小梁呈条状、分枝状等（黑色箭头），骨陷窝较丰富（红色箭头），表面覆盖成骨细胞；骨髓腔较丰富的造血细胞和少量脂肪细胞（蓝色箭头）D：仙灵骨葆胶囊组组织结构较清晰；骨骺厚度较均匀，软骨细胞排列较整齐，骨骺处少量新生松质骨（蓝色箭头）；较丰富的骨小梁呈条状、分枝状等，较丰富的骨陷窝，表面覆盖成骨细胞；骨髓腔较丰富的造血细胞Fig.3 Histomorphological images of pathological sections of rabbit femoral head in different groupsA: normal group,dense trabeculae,metaphyseal cancellous bone (blue arrows indicated),rich bone lacuna,and surface was covered with osteoblasts.The marrow cavity was rich in hematopoietic cells; B: model group,local metaphyseal deformation (red arrows indicated),slight thickening,uneven.Trabeculae was hyperplasia and sparsely distributed,metaphyseal cancellous bone (blue arrows indicated).Bone lacunae can be seen and surface was covered with osteoblasts.There were hematopoietic cells and adipocytes in the bone marrow cavity (black arrow indicated).Metaphyseal trabecular bone decreased (green arrow indicated); C: Shenggu Zaizao pill group,clear organizational structure;uniform epiphyseal thickness (green arrow indicated),orderly arranged chondrocytes.Bone trabeculae were striated and branched (black arrows indicated),lacunae were abundant (red arrows indicated),and the surface was covered with osteoblasts.There were abundant hematopoietic cells and few adipocytes in the bone marrow cavity (blue arrows indicated);D: Xianling Gubao capsule group,clear organizational structure.Uniform epiphyseal thickness,orderly arranged chondrocytes,and there was little new cancellous bone in epiphyseal area (blue arrow).Bone trabeculae were strip and branched,and lacunae were covered with osteoblasts.Hematopoietic cells were abundant in bone marrow lumen

2.4 空骨陷窝改变

与正常组相比，模型组总骨陷窝数无明显变化，空骨陷窝数和空骨陷窝率显著升高，差异具有统计学意义（P＜0.05）；与模型组相比，生骨再造丸组和仙灵骨葆胶囊组空骨陷窝数和空骨陷窝率都明显下降，差异具有统计学意义（P＜0.05），证明生骨再造丸和仙灵骨葆胶囊对SONFH 兔股骨头空骨陷窝率作用确切；生骨再造丸组和仙灵骨葆胶囊组结果无明显差异（P＞0.05），两种药物治疗作用相当(图4，5)。

图4 兔股骨头空骨陷窝A：正常组B：模型组C：生骨再造丸组D：仙灵骨葆胶囊组Fig.4 The hollow bone lacuna of the femoral head of rabbitA: Normal group; B: Model group; C: Shenggu Zaizao pill group; D: Xianling Gubao capsule group

3 讨论

SONFH 是长期或大剂量使用GC 导致骨内循环障碍、骨细胞代谢失衡，股骨头局部结构改变、塌陷，引起髋关节疼痛、功能障碍的骨科疾病，脂质代谢紊乱、BMSCs 分化失衡和骨质疏松是其主要的发病机制。使用高剂量激素会使患者皮下脂肪动员显著增加，随着给药时间延长，引起血脂增高并导致高脂血症，使体内血液趋于停滞，此时全身脂肪栓塞情况严重，股骨头微小颗粒形成脂肪栓直接导致局部血瘀，骨髓被大量脂肪细胞占据，脂肪细胞融合成碎片造成骨髓衍生细胞死亡，最终导致股骨头缺血性坏死[11,12]。骨质疏松是SONFH 发生的重要机制，GC 能够大量消耗蛋白质并使其合成减低，同时对抗维生素D 并使胃肠道对钙吸收产生障碍，从而造成大量钙被排泄[13]。另一方面，大剂量应用GC 可降低成骨细胞的活性并抑制破骨细胞骨吸收，减少骨转换[14]。通过激活或抑制成骨和成脂相关转录调控因子，影响间充质干细胞的分化，最终使BMSCs 来源的脂肪细胞的大小和数量显著增加，造成成骨细胞数量显著减少，此时骨小梁严重稀疏引起骨质疏松，最终导致股骨头承重区塌陷，甚至坏死[15]。在此过程中，GC 可能通过调 节Runx2，Osterix 和MMP-13参与SONFH的形成[16]。因此，调节BMSCs 成骨、成脂分化功能，纠正骨代谢紊乱，减少骨内脂肪细胞生成，促进骨吸收，以促进骨小梁的生长并加强其应力，对防治SONFH 具有重要意义。

图5 各组股骨头空骨陷窝率比较A：正常组B：模型组C：生骨再造丸组D：仙灵骨葆胶囊组* P＜0.05，与正常组比较 #P＜0.05，与模型组比较Fig.5 Comparison of lacuna rate of femoral head in each groupA: Normal group; B: Model group; C: Shenggu Zaizao pill group; D: Xianling Gubao capsule groupCompared with group A,*P＜0.05;Compared with group B,#P＜0.05

中医认为，GC 属“药邪”，为“纯阳”之品，大剂量或长期使用可损耗肾阴肾精[17]，导致脾、肝、肾等脏器受损。《脾胃论》曰：“脾病则下流乘肾……是为骨蚀，令人骨髓空虚。”脾失健运，聚湿生痰，痰湿蕴结，流注关节，痰瘀互结，阻滞于四肢百骸、筋经血脉；加之肝肾不足，筋骨失荣，骨肉不相亲，最终导致骨枯髓空，发为骨痹。故本病病性属脾肝肾三脏亏虚为本，痰瘀互结为标。肝肾亏虚是SONFH 发病的基础，痰湿蕴滞是SONFH 发病的重要病机，血瘀是SONFH 的病理产物和致病因素[18,19]。生骨再造丸是甘肃中医药大学附属医院院内制剂，该方中淫羊藿、鹿角胶、骨碎补等补益肝肾、强筋壮骨；黄芪、桂枝、茯苓、泽泻等补气通阳、健脾利湿，丹参、三七、龙血竭、山楂等舒筋散结、活血化瘀。以上药物合用则阳气顺以升腾，津液输布有序，共奏通阳、利湿、活血之效，在临床中已经被证实能够有效缓解SONFH 患者的髋关节疼痛、活动障碍等症状。实验室研究也已经证明，生骨再造丸可有效抑制SONFH 大鼠IL-4、IL-6、TNF-α mRNA 表达水平，上调VEGF 及其受体FLT-1 的表达，促进血管重塑，明显改善股骨头局部缺氧缺血环境，进一步促进坏死的股骨头组织修复，这可能是抑制SONFH 发展的机制之一[20～22]。

Micro-CT 是全面、立体测量骨微结构、评价骨质量及预测骨强度的新兴技术[23～25]，从骨细胞水平到影像学表现反应其病理变化和骨质情况，为临床治疗和评价药物作用提供更为明确的实验和理论依据[26,27]。骨组织形态计量学依据骨组织学和病理生理学，将切片和Micro-CT 扫描结合，对SONFH 股骨头组织形态病理变化和影像学三维重建、计量学参数进行分析，其主要指标及意义如下：骨骼矿物质密度（bone mineral density，BMD），发生骨质疏松时BMD 值降低；BV/TV：感兴趣区域内骨小梁体积和总体积的比值，减小表示骨量减少；骨小梁平均厚度（Tb.Th），发生骨质疏松时，Tb.Th 值减小；骨小梁数量（Tb.N），即给定长度内骨组织与非骨组织的交点数量，发生骨质疏松时Tb.N 值减小；骨小梁之间的髓腔平均宽度（Tb.Sp），Tb.Sp 增加提示骨吸收增加，可能发生骨质疏松；骨小梁连通性（Conn.D），骨小梁结构之间的相互连接程度，连通性降低，可能发生骨疾病；骨小梁结构模型指数（SMI），骨小梁板状和杆状梁的程度，发生骨质疏松时板状骨小梁减少，杆状骨小梁增加，SMI 数值增加[28]。本研究结果显示，经生骨再造丸与仙灵骨葆胶囊治疗的SONFH 兔股骨头BMD、BV/TV、Tb.N、Tb.Th 和Conn.D 等骨计量学参数明显升高，Tb.Sp、SMI 降低；组织形态病理学观察显示骨小梁、骨骺、脂肪细胞、空骨陷窝等明显改善，从骨形态计量学角度证明对兔SONFH 有确切的治疗作用。

综上所述，本研究以生骨再造丸治疗兔SONFH模型，经Micro-CT 扫描三维重建和组织病理切片形态学观察分析，结果显示生骨再造丸可显著改善股骨头组织病理形态，提升骨计量学指标水平，证明生骨再造丸对SONFH 具有一定的修复作用，值得临床推广应用。