川崎病患儿血清酸性鞘磷脂酶、钙调神经磷酸酶水平和炎症因子表达的相关性以及与免疫球蛋白治疗效果的关系研究

张俊民，许爱平，赵利平，代宝春，张 娟（邯郸市中心医院儿科，河北邯郸 056000)

川崎病（Kawasaki disease，KD）是一种不明原因导致的急性、自限性、发热性、系统性血管炎症，约20%～25%未经治疗的 KD 患儿会发生冠状动脉病变[1]。静脉注射免疫球蛋白（intravenous immunoglobulin，IVIG）能调节免疫功能，抑制全身炎症反应，是KD治疗的一线用药，可降低冠状动脉瘤发生率[2]，但是IVIG治疗反应性个体差异较大，部分患儿对IVIG治疗无反应。现有观点认为免疫系统异常激活、过度炎症反应可能与IVIG治疗无反应有关[3]。酸性鞘磷脂酶（acid sphingomyelinase，ASM）是一种溶酶体糖蛋白，可将鞘磷脂水解为神经酰胺，ASM 激活与细胞应激、炎症反应以及血管内皮功能障碍有关[4]。钙调神经磷酸酶（calcineurin，CaN）是一种由钙激活的蛋白磷酸酶，激活后会触发钙信号通路，上调炎症细胞因子表达，CaN水平升高与冠状动脉炎症反应有关[5]。为了解血清ASM，CaN与KD的关系以及在KD中的临床应用价值，本研究拟检测KD患儿血清ASM，CaN水平，分析其与KD患儿炎症反应和IVIG治疗效果的关系，结果报道如下。

1 材料与方法

1.1 研究对象 选择2017年2月～2020年3月邯郸市中心医院收治的196例KD患儿（KD组），男性123例，女性73例，年龄3～6（4.85±0.49）岁；体重11～28（18.80±6.41）kg；发热时间2天～15天，平均5.69±2.19天。纳入标准：①符合《川崎病的诊断、治疗和长期管理:来自美国心脏协会的健康专业人员的科学声明》中相关诊断标准[6]；②初次诊断为KD，处于急性期；③均发病10天内接受IVIG联合阿司匹林治疗。排除标准：①复发性KD；②入组前已经接受IVIG治疗；③对IVIG治疗过敏者。另选择同期于我院进行体检的198例健康儿童为对照组，男性131例，女性67例，年龄4～6（4.90±0.42）岁，体重13～30（19.63±6.71）

kg；均排除先天性心脏病、遗传病、急慢性感染。KD组和对照组儿童监护人均知情同意本研究且签署同意书，两组性别、年龄、体质量比较差异无统计学意义（P＞0.05），本研究获得我院伦理委员会批准。

1.2 仪器与试剂 Varioskan LUX 多功能酶标仪（美国赛默飞世尔公司）；酶联免疫吸附试验所用试剂盒（上海酶联生物科技有限公司）；AU5800全自动生化分析仪，DxH800血细胞分析仪，DxH800血细胞分析仪（美国贝克曼公司）；Roller 20 MicroTEST1全自动血沉仪（意大利ALIFAX公司）；iE Elite 四维心血管彩超仪（荷兰飞利浦公司）。

1.3 方法

1.3.1 实验室检测：于KD患儿入院当日（对照组体检当日清晨）采集静脉血标本7ml，分装为3管。其中一管（3ml）室温下静置30min，离心（室温，3 000r/min，半径10cm）10min分离血清上机检测，当日未完成检测的样本-80℃保存。采用Varioskan LUX 多功能酶标仪运用酶联免疫吸附试验检测血清ASM，CaN，白细胞介素（interleukin，IL）-2，白细胞介素（interleukin，IL）-6，肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF）-α和C反应蛋白（C-reactive protein，CRP）水平，AU5800全自动生化分析仪检测血清清蛋白（albumins，Alb），丙氨酸氨基转移酶（alanine aminotransferase，ALT）水平。另一管（2ml）注入EDTA抗凝试管，不经离心处理，采用DxH800血细胞分析仪检测中性粒细胞比例、白细胞计数（white blood cell count，WBC）、血小板（blood platelet count，PLT）、血红蛋白（hemoglobin，Hb）。第三管（2ml）注入含3.2g/dl枸橼酸钠试管，Roller 20 MicroTEST1全自动血沉仪采用魏氏法测定红细胞沉降率。所有试剂盒批内和批间变异系数控制在5%以内。飞利浦iE Elite 四维心血管彩超仪测量左冠状动脉主干和右冠状动脉内径，测量3次，取平均值，根据公式计算冠状动脉Z值，Z值=[In冠状动脉实测值（cm）- β1- β2×In体表面积（m2）]/均方误差值，β1，β2为冠状动脉的系数[7]。彩超由我院超声医学科2名10年以上工作经验的超声医师操作完成。

1.3.2 临床治疗：KD患儿入组后均给口服阿司匹林肠溶片（Bayer Vital GmbH，规格100mg/片，批准文号H20130339）30～50mg/kg/d，单次静脉滴注人免疫球蛋白(pH4)[（国药准字S20023011，国药集团上海血液制品有限公司，规格2.5g(50ml)/瓶]2g/kg/d治疗。患儿体温恢复正常3天后或病程14天后，阿司匹林肠溶片剂量逐渐减至3～5mg/kg/d，6～8周且冠状动脉恢复正常后停用。

1.3.3 IVIG治疗反应性判定：初次IVIG治疗后仍持续发热36h或以上，或者再度发热归为IVIG无反应组（31例），体温恢复正常者归为IVIG反应组（165例）[6]。

1.4 统 计 学 分 析 SPSS 25.0进 行 数 据 分 析。计量资料均符合正态分布，仅少量有轻微偏态（Kolmogorov-Smirnov法检验），以均数±标准差（±s）表示，采用配对或成组t检验(含校正t检验)。计数资料以[n(%)]表示采用χ2检验。ASM，CaN与IL-2，CRP，IL-6，TNF-α之间相关性采用Pearson检验。多因素Logistic回归分析KD患儿IVIG治疗效果的影响因素。检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 KD组与对照组血清ASM，CaN及炎症因子水平比较 见表1。KD组患儿血清ASM，CaN，IL-2，CRP，IL-6和TNF-α水平均高于对照组，差异有统计学意义（均P＜0.05）。

表1 KD组与对照组血清ASM，CaN及炎症因子水平比较（±s）

表1 KD组与对照组血清ASM，CaN及炎症因子水平比较（±s）

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2.2 血清ASM，CaN水平与炎症因子的相关性 经Pearson相关性分析显示：血清ASM，CaN水平与IL-2，CRP，IL-6，TNF-α水平均呈正相关，差异有统计学意义（rASM=0.482, 0.521, 0.479, 0.396,rCaN=0.342, 0.512, 0.465, 0.485, 均P＜0.05）。

2.3 IVIG治疗效果影响因素的单因素分析 见表2。IVIG反应组血清ASM，CaN，CRP，IL-6水平、发热时间、中性粒细胞比例、白细胞计数均低于IVIG无反应组，差异有统计学意义（t=5.969～18.252，均P＜0.05）；两组年龄、性别、体重、血小板、血红蛋白、红细胞沉降率、清蛋白、丙氨酸氨基转移酶、左冠状动脉主干Z值、右冠状动脉冠脉Z值、IL-2，TNF-α比较差异均无统计学意义（均P＞0.05）。

表2 IVIG治疗效果影响因素的单因素分析

2.4 IVIG治疗效果影响因素的多因素Logistic回归分析 回归设计：建立非条件Logistic回归模型，以本研究KD患儿资料为样本，以IVIG治疗效果为因变量，以前述单因素分析中P＜0.10的指标为自变量，为提高统计效率并使回归结果清晰，也考虑到阳性样本量较少，将部分为连续数值的自变量，按两组总均值进行分段（分层），转化成两分类变量。各变量赋值均尽可能咨询专业统计人员，参考应变量危险方向进行赋值，见表3。回归过程采用逐步后退法，以进行自变量的选择和剔除，设定α剔除=0.10，α入选=0.05。回归结果：ASM，CaN，CRP均是KD患儿IVIG治疗效果的影响因素（P＜0.05），见表4。

表3 赋值设计

表4 IVIG治疗效果影响因素的多因素Logistic回归分析结果

3 讨论

川崎病（KD）是一种急性发热性全身性血管炎，其发病机制尚不清楚，一般认为是遗传因素、感染和免疫等多种因素经过复杂相互作用的结果，其主要病理基础为全身脉管系统炎症反应，大量巨噬细胞、淋巴细胞、单核/巨噬细胞浸润，激活免疫球蛋白、炎性因子、基质金属蛋白酶等细胞因子，驱使白细胞、粒细胞迁移浸润于血管炎症部位，引起脉管炎症症状[8-9]。多数KD患儿病程呈自限性，但随着KD进展，其会导致冠状动脉瘤和血栓栓塞等严重并发症，因此需要早期诊断和控制疾病进展。目前控制炎症反应是治疗KD的关键，IVIG作为治疗KD的一线用药，多数患儿经静脉注射免疫球蛋白（IVIG）治疗后可退热，但仍有10%～20%患儿对IVIG治疗无反应[10]，需要额外的抗炎治疗。IVIG治疗无反应可增加冠状动脉损伤风险，导致青少年时期早发动脉粥样硬化、心肌梗死[11]。现有研究显示过度炎症反应是IVIG治疗无反应的危险因素[12]。因此探讨与KD炎症反应相关的生物学指标，有助于评估KD患儿IVIG治疗效果。

酸性鞘磷脂酶（ASM）是鞘脂类代谢的关键酶，位于染色体11p15.1-11p15.4，通过水解鞘磷脂生成神经酰胺、神经鞘氨醇等活性脂类，调节膜结构和信号转导[13]。ASM/神经酰胺信号通路具有介导炎症反应和细胞凋亡的作用，在动脉粥样硬化、心力衰竭等心血管疾病发病过程中扮演重要角色[14]。现有研究显示ASM/神经酰胺信号通路活化可抑制内皮型一氧化氮合酶磷酸化，增加血管环超氧阴离子含量，进而导致动脉内皮功能障碍[15]。ASM还可调节辅助性T淋巴细胞2（helper T lymphocyte 2，Th2）细胞因子释放，ASM激活可引起Th2细胞分化，Th2细胞因子白细胞介素-5释放，加重局部炎症反应[16]。本研究发现KD患儿血清ASM水平明显高于对照组，IVIG反应组血清ASM水平明显低于IVIG无反应组，多因素Logistic回归分析结果显示ASM是KD患儿IVIG治疗效果的影响因素之一，以上结果共同说明血清ASM水平升高与KD发病以及IVIG治疗效果有关。分析原因为：KD脉管炎症反应可刺激ASM激活和易位，导致神经酰胺释放，ASM/神经酰胺信号通路激活后进一步调节细胞因子释放，放大炎症反应，并促使细胞凋亡[17]，加速KD病情进展，导致IVIG治疗无反应。本研究相关性分析结果也显示血清ASM水平与IL-2，CRP，IL-6，TNF-α均呈正相关，说明ASM可能通过诱导或加重炎症反应，导致KD患儿对IVIG治疗无反应。

钙调神经磷酸酶（CaN）是一种Ca2+/钙调蛋白依赖性丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶，在心肌细胞、神经细胞、骨骼肌细胞、淋巴细胞等不同类型细胞中广泛表达，参与细胞增殖分化、突触传递和神经递质释放，T细胞活化、线粒体功能障碍、炎症反应和蛋白质糖基化等病理生理过程[18-19]。现有研究发现细胞内Ca2+信号传导通路异常是KD易感的主要影响因素，游离胞质Ca2+的浓度增加可导致 T 细胞中CaN过度活跃，继而激活 T 细胞，导致单核细胞/巨噬细胞过度分泌白细胞介素-1β和TNF-α，诱导脉管炎症反应，该炎症反应进一步诱导尾加压素-2信号传导，加速血管内皮细胞凋亡[20]。本研究发现KD患儿血清CaN水平明显升高，且CaN是IVIG治疗效果的影响因素。分析可能的机制为：在应激刺激下细胞内Ca2+浓度升高，T 细胞中CaN被激活，激活的CaN使活化T细胞核因子（nuclear factor of active T cells，NFAT）去磷酸化，调节NFAT靶基因转录，介导黏附分子和促炎细胞因子表达[21]，进而促使炎症细胞浸润，加剧血管炎性损伤，导致IVIG治疗无反应。另外，CaN亚基B与线粒体结合可增加细胞中Ca2+浓度和CaN活性，促使半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3和TNF-α表达，介导炎症反应[22]，影响IVIG治疗效果。本研究相关性分析结果也显示CaN与KD患儿血清炎症因子有关，说明CaN可能通过介导脉管炎症反应导致IVIG治疗无反应的发生。本研究Logistic回归分析结果显示CRP与IVIG治疗无反应存在密切关系，亦佐证了炎症反应与IVIG治疗无反应的关系。

综上，KD患儿血清ASM，CaN水平均升高，且ASM，CaN与IVIG治疗效果有关。ASM，CaN可能通过诱导炎症反应参与IVIG治疗无反应的发生。临床可通过检测血清ASM，CaN水平变化，辅助判断KD患儿IVIG治疗反应性，及时调整治疗策略，改善患儿预后。本研究局限性在于未分析ASM，CaN与KD患儿冠状动脉损伤之间的关系，望在以后研究中进行分析。