miR-335通过下调Fra-1表达抑制人乳腺癌细胞增殖机制的实验研究

刘 冲，张 静，李 胜，赵 奇

(1.湖北理工学院附属妇幼保健院（儿童医院）/鄂东医疗集团黄石市妇幼保健医院医学检验科，湖北黄石 435000；2.黄石爱康医院a. 医学检验科；b.医学骨科，湖北黄石 435000）

乳腺癌（breast cancer）是一种高发于女性的恶性肿瘤，我国近年来呈现出高发趋势，乳腺癌的发生发展与体内多种癌基因的活化密切相关[1]。微小核糖核酸（microRNA，miR）是一类参与体内基因表达的内源性单链小分子RNA片段，参与体内多种生理病理过程的调控[2]。研究表明，miR-335在不同类型的肿瘤细胞中表达存在差异，在乳腺癌、胃癌、肝癌等多种癌细胞中表达下降，可以抑制上述肿瘤细胞的侵袭转移[3]；原癌基因 Fros相关抗原-1(fros related antigent-1, Fra-1)是FOS 基因家族的一员，其表达产物是转录因子激活蛋白-1(activator protein-1, AP-1)的重要组成部分， Fra-1参与调控体内肿瘤细胞的分化凋亡，与肿瘤的转移、血管生成密切相关[4]。本研究通过上调miR-335在乳腺癌细胞中的表达，探讨miR-335在调控乳腺癌细胞增殖相关基因Fra-1的表达及miR-335影响Fra-1启动子转录的分子机制，为后续研究针对miR-335和Fra-1靶向治疗提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 细胞来源 人乳腺癌细胞系MCF-7，人正常乳腺细胞系MCF-10A均购于美国模式菌种收集中心（American Type Culture Collection, ATCC）。

1.2 仪器与试剂 RNA提取试剂盒、逆转录试剂盒、PCR试剂盒、Lipofectamine 2000转染脂质体试剂盒（Invitrogen公司）；Fra-1, MMP-9, VEGF-C鼠源单克隆抗体（Cell Signaling公司）；miR-335 mimic及 mimic control（广州锐博公司）；CCK-8试剂盒（上海汉恒生物有限公司），荧光素酶报告基因试剂盒（美国Promega公司）；引物由上海生物工程公司合成；胎牛血清（Sigma公司）；DMEM培养液（Gibco公司）。

1.3 方法

1.3.1 细胞培养：复苏MCF-7和MCF-10A细胞，置于37℃, 5ml/dl CO2培养箱中，细胞培养使用含10g/dl胎牛血清的DMEM培养液，待细胞生长至对数生长期使用0.25g/dl的胰酶消化，抽提总RNA及总蛋白备用。

1.3.2 细胞转染：使用胰酶消化处于对数生长期的MCF-7细胞，将细胞密度调整至2×105/孔接种于6孔板中培养，24h后将浓度为50nmol/L的miR-335 mimic转染细胞 ，同时设转染mimic control的细胞为对照组，48h后提取细胞总RNA，总蛋白用于后续实验。

1.3.3 细胞增殖实验：miR-335 mimic转染MCF-7细胞，48h后消化细胞并计数，转种到96孔板中，向贴壁细胞中加入10μl/孔的CCK-8试剂溶液，待培养24, 48, 72h后用酶标仪测定450nm处的吸光度数据绘制细胞生长曲线。

1.3.4 蛋白检测：提取各实验组和对照组培养细胞的总蛋白，测定提取蛋白的浓度，按照Westernblot法检测各组蛋白表达水平。

1.3.5 mRNA检测：收集转染后的各组细胞，总RNA提取依据Trizol试剂盒说明书进行，Invitrogen试剂盒说明书进行逆转录反应获取cDNA进行RT-PCR扩增检测，引物序列见表1。

表1 miR-335，U6，Fra-1，MMP-9，VEGF-C，GAPDH的引物序列表

1.3.6 Fra-1启动子转录活性检测：分别构建Fra-1启动子双荧光霉素报告载体（命名为pGL3B-2163）及不同长度的短截报告载体（根据长度分别命名为

pGL3B-1475, pGL3B-880, pGL3B-676, pGL3B-386,pGL3B-256），取 对 数 生 长 期 的MCF-10A和MCF-7细胞至24孔细胞培养板中培养，待细胞完全贴壁后转染Fra-1启动子报告载体，同时分别转染miR-335 mimic及 mimic control作为实验组和对照组，转染荧光霉素内参报告载体pRL-TK，培养5h后更换完全培养液（含10g/dl胎牛血清）培养48h后收集细胞，裂解细胞并检测荧光蛋白活性。

1.4 统计学分析 采用SPSS.22.0软件分析数据，所有实验均重复三次，计量资料采用均数±标准差（±s）表示，两组比较采取t检验，不同时间比较采用重复测量设计方差分析，以P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 乳 腺 癌MCF-7细 胞 系中miR-335，Fra-1表达情况 乳腺癌MCF-7细胞中miR-335的表达量（0.755±0.034）低于正常乳腺细胞MCF-10A的表达量（1.495±0.029），Fra-1蛋白的表达量（2.347±0.120）高于正常乳腺细胞MCF-10A的表达量（1.319±0.038），差异均有统计学意义（t=0.075,4.191, 均P＜0.001）。

2.2 miR-335调控Fra-1蛋白表达对乳腺癌细胞增殖的影响 见表2。RT-PCR结果显示转染miR-335 mimic后细胞中miR-335（1.761±0.059）的表达量高于对照组（0.735±0.029），差异有统计学意义（t=1.465,P＜0.001）；Western blot检测显示上调miR-335后细胞中Fra-1（0.567±0.091）的蛋白表达量低于对照组（2.347±0.204），差异有统计学意义（t=3.763,P＜0.001）。转染miR-335 mimic后分别于24，48和72h检测乳腺癌细胞增殖率，结果显示时间、组别对乳腺癌细胞MCF-7的增殖能力有明显影响（F时间=226.395,F组别=98.733,F时间*组别=12.081, 均P＜0.001）；与对照组相比，共培养48和72h实验组的细胞增殖能力低于对照组，差异均有统计学意义（t=44.096, 59.307, 均P＜0.001）。

表2 miR-335对MCF-7细胞增值能力的影响（n=3，±s）

表2 miR-335对MCF-7细胞增值能力的影响（n=3，±s）

?

2.3 miR-335对乳腺癌细胞增殖相关蛋白MMP-9及VEGF-C的调控 见表3。RT-PCR结果显示MMP-9和VEGF-C的mRNA表达量低于对照组，差异均有统计学意义（t=1.722，2.202，均P＜0.001）；Western blot检测结果显示上调miR-335后的乳腺癌细胞中MMP-9和VEGF-C的蛋白表达量低于对照组，差异有统计学意义（t=1.953, 7.856, 均P＜0.001）。

表3 miR-335对乳腺癌MCF-7细胞MMP-9，VEGF-C表达水平影响（n=3，±s）

表3 miR-335对乳腺癌MCF-7细胞MMP-9，VEGF-C表达水平影响（n=3，±s）

?

2.4 miR-335调控Fra-1启动子转录活性分析 见表4，图1。Fra-1启动子转录活性分析显示，乳腺癌细胞系MCF-7中Fra-1启动子的转录活性（5.384±0.431）高于正常人乳腺细胞MCF-10A的转录活性（3.238±0.103），差异有统计学意义（t=8.977,P＜0.05）；MCF-7细 胞 转 染miR-335后Fra-1启动子的转录活性低于对照组，差异有统计学意义（t=9.293,P＜0.05）；Fra-1启动子系列短截荧光霉素报告基因分析结果显示，转染miR-335 mimic及 mimic control的 乳 腺 癌 细 胞Fra-1启 动子系列短截报告载体（pGL3B-1475, pGL3B-880,pGL3B-368）分别与全长报告载体（pGL3B-2163）荧光活性比较，差异均无统计学意义（t=0.722, 0.501,0.917, 均P＞0.05），短截报告载体pGL3B-256荧光活性则低于全长启动子报告载体（pGL3B-2163）的活性，差异有统计学意义（t=28.747,P＜0.05）。以上实验结果说明乳腺癌细胞MCF-7中Fra-1启动子上游-164nt～-52nt区域中有着重要的调控转录区域；分别转染miR-335 mimic及 mimic contro的乳腺癌细胞中，miR-335 mimic转染组短截报告 载 体pGL3B-256与mimic control组 报 告 载 体pGL3B-256相比，差异无统计学意义（t=0.401,P＞0.05）。说明miR-335调控Fra-1启动子活性的核心调控区域也是在-164nt～-52nt区域。

图1 miR-335调控靶基因Fra-1启动子转录活性分析

表4 乳腺癌MCF-7及正常乳腺MCF-10A细胞Fra-1启动子转录活性分析（n=3，±s）

表4 乳腺癌MCF-7及正常乳腺MCF-10A细胞Fra-1启动子转录活性分析（n=3，±s）

?

3 讨论

乳腺癌是女性患者中最常见的恶性肿瘤之一，高发于40～60岁更年期前后的女性患者，流行病调查结果显示，乳腺癌的全球女性发病率为24.2%[5]，乳腺癌是一种多因素、多阶段、多基因参与的疾病，与遗传易感基因的多态性、遗传性相关的疾病[6]。研究表明，miR-335在乳腺癌、胃癌、宫颈癌及前列腺癌中低表达，并发挥着抑癌基因的作用，但在非小细胞肺癌中高表达，并发挥着促癌基因的作用[7]，miR-335可调节转录因子SP1（transcription factor SP1）、Rho相 关 卷 曲 螺旋形成蛋白激酶1(Rho associated coiled coil forming protein kinase 1, ROCK1)等多个靶基因来调节肿瘤细胞的增殖和分化[8]，在乳腺癌细胞中，miR-335可通过靶向生存素抑制乳腺的增殖，从而抑制肿瘤的侵袭[9]。Fra-1作为Fos家族中的一员，参与了多种肿瘤的恶性进展，Fra-1过表达启动了肿瘤恶性进展相关基因的转录并诱导上皮细胞间质化，使肿瘤细胞获得较强的侵袭转移能力[10]。Fra-1在高侵袭性的乳腺癌中表达明显增高，可促进乳腺癌细胞的增殖、黏附和迁移的能力[11]，研究表明，在体外培养的乳腺癌细胞株中，反式作用因子AP1通过激活Fra-1基因启动子上调其表达[12]。

miR-335和Fra-1与乳腺癌的发生发展有着密切的关系，我们前期的实验研究发现miR-335与Fra-1在乳腺癌组织学水平和细胞学水平呈负相关关系，课题组在先期研究结果的基础上进一步深入探讨乳腺癌细胞中miR-335表达与Fra-1及下游肿瘤侵袭转移相关蛋白之间相互影响机制。通过RTPCR和蛋白质免疫印迹技术检测人乳腺癌细胞株MCF-7中miR-335和Fra-1的表达情况，与正常人乳腺细胞MCF-10A相比，MCF-7中miR-335表达下调，而Fra-1表达上调，上述研究结果与杨浚沨等[13]人的研究结果一致。研究表明，在胃癌、直肠癌、非小细胞肺癌、乳腺癌等肿瘤组织中基质金属蛋白酶（MMP-9）均高表达，MMP-9以酶原的形式分泌,被激活后形成Ⅳ型胶原酶可以降解破坏细胞外基质中的Ⅳ型、Ⅴ型胶原和明胶,促进肿瘤细胞沿着缺失的基底膜向周围组织浸润[14]；血管内皮生长因子C(VEGF-C)可以增强血管的通透性从而促进血浆蛋白外渗形成临时血管基质，有利于肿瘤组织血管形成，在肺癌、胃癌、肝癌等多种实体肿瘤中均高表达，可以促使肿瘤组织中新血管形成增加肿瘤供血从而促进了肿瘤组织的生长[15]。研究表明Fra-1可以通过激活诱导MMP-9和VEGF-C的表达促进细胞的侵袭能力，也可以直接与MMP-9结合诱导靶基因的转录[16]。在乳腺癌细胞中混合谱系激酶3（mixed lineage kinase 3, MLK3）可以诱导Fra-1的表达上调，并伴有MMP-9和VEGF-C的表达升高，从而促进肿瘤的增殖与侵袭[17]。我们因此推断在乳腺癌细胞中miR-335可能在下调Fra-1表达的同时也会影响MMP-9和VEGF-C的表达，从而抑制细胞的增殖、侵袭和转移，为进一步证实我们的想法，通过上调乳腺癌细胞株MCF-7中miR-335的表达量，发现上调miR-335后的乳腺癌细胞中Fra-1的表达量明显受到了抑制，同时检测与乳腺癌细胞增殖转移能力相关的蛋白MMP-9和VEGF-C的表达情况，二者的表达明显均受到了抑制。CCK-8法检测上调miR-335表达后的乳腺癌细胞的细胞增殖能力，发现其细胞增殖能力也明显受到了抑制。基因启动子是调控基因表达的重要序列，RNA聚合酶可以特异性识别从而控制转录的起始，启动子区域还存在着多个转录因子调控位点，转录因子和RNA聚合酶共同调节基因在细胞内的表达[18]。为进一步探明乳腺癌细胞中miR-335调控Fra-1表达的分子机制，我们构建了Fra-1启动子全长的荧光霉素报告载体，同时利用生物信息学预测软件并结合相关的文献报道构建了系列Fra-1启动子荧光霉素短截报告载体，通过分析上述启动子的活性，研究发现乳腺癌MCF-7细胞株Fra-1启动子上游-164nt～-52nt区域中有着重要的调控转录区域，miR-335通过调控该区域的启动子转录来抑制Fra-1的转录启动，上述研究结果与周秋媛等[19]人关于乳腺癌细胞中Fra-1启动子高转录活性分子机制的研究结论是一致的。基因启动子是调控基因表达的关键序列，是被RNA聚合酶识别辨认的区域，是基因转录起始的开关[20]，上述实验结果说明乳腺癌细胞中miR-335可以影响Fra-1启动子的转录起始来抑制基因的表达。通过生物信息软件预测分析显示，该区域有SP1，AP1，AP2和EGR1等多个转录因子结合位点，我们推测miR-335可能是通过影响上述转录因子与Fra-1启动子的结合来调控Fra-1基因在乳腺癌细胞中的转录，我们将在后续通过凝胶迁移阻滞实验和染色质免疫共沉淀技术来进一步寻找miR-335影响Fra-1启动子调控的分子机制。

综上所述，本课题阐明乳腺癌细胞中miR-335通过调控Fra-1启动子核心转录区域（-164nt～-52nt）抑制转录，同时抑制MMP-9和VEGF-C的表达来抑制乳腺癌细胞的增殖转移能力。miR-335作为一种肿瘤抑制小分子miRNA，可能通过调节细胞内多个信号转导通路的靶基因的表达来改变信号转导通路的活性[21]，从而影响肿瘤细胞的增殖转移，miR-335对Fra-1的负性调控作用可能是上述信号转导通路中多个靶基因中的一个，本课题研究结果对后续研究乳腺癌增殖转移机制有一定的参考价值，随着研究的进一步深入，miR-335调控Fra-1表达可能成为治疗乳腺癌的一个新策略。