基于网络药理学和实验验证探讨白虎加人参汤治疗2型糖尿病的分子机制＊

黄雅兰，张艳玲，吴勇军，刘 秀，向 琴，喻 嵘＊＊

（1.湖南中医药大学研究生院 长沙 410208；2.湖南中医药大学中医学院 长沙 410208；3.湖南中医药大学药学院 长沙 410208；4.湖南中医药大学科技处 长沙 410208）

1 引言

糖尿病（diabetes mellitus，DM）是一组以高血糖为特征，出现多尿、多食、多饮、疲乏无力等症状的慢性疾病，其主要分为两型，尤以2型糖尿病（type 2 diabetes mellitus，T2DM），又称非胰岛素依赖型糖尿病最多见，T2DM主要由遗传因素、不良的生活方式、免疫功能紊乱等致病因子作用于机体，导致胰岛功能减退、胰岛素抵抗[1-3]。国际糖尿病联盟（International Diabetes Federation，IDF，http://diabetesatlas.org/en/）于2019年发布数据显示，全球DM患者大约有4.63亿，中低等收入国家占到79%，我国DM患病人数在全世界排名第一，高达1.16亿，预计到2045年中国DM人数将达到1.47亿[4]。血糖长期处于异常水平可并发糖尿病肾病、糖尿病心肌病等，其致死致残率极高，给人类的健康甚至生命造成严重威胁，已经成为我国最为重要和棘手的公共卫生问题之一[5]。

目前T2DM的治疗以西药为主，西药类降糖药多为促胰岛素分泌剂、二肽基肽酶-4抑制剂、双胍类、胰高血糖素样肽-1受体激动剂、α-糖苷酶抑制剂、噻唑烷二酮类药物、胰岛素及其类似物等[6]。虽然西药类降糖药在改善血糖相关指标上表现出相对优势，但其作用途径单一，对并发症的作用有限，且不良反应明显，以反应性低血糖多见，也容易对心、肝、胃、肾等造成损伤[7]。因此亟待寻求有效控制T2DM的治疗方案。中医药在改善T2DM胰岛素抵抗方面，具有现代医学不可替代的优势。许多中药及中药提取物，能保护β细胞、促进胰岛素分泌、提高胰岛素的敏感性以及促进葡萄糖降解等作用，从而达到改善胰岛素抵抗的效果[8]。此外还能够通过调节肠道微生物群结构和改善免疫系统功能等途径，纠正糖脂代谢紊乱[9]。中药复方注重整体治疗，具有多成分、多靶点、协同作用的特点，在治疗T2DM及其并发症具有独特优势，能够从多方面改善机体代谢水平，维持机体稳态，达到缓解DM及控制并发症的最终目的，越来越受到人们关注，为T2DM的防治提供全新的思路[10]。

T2DM属传统医学中“消渴”症范畴，《黄帝内经》认为五脏虚弱、过食肥甘是消渴的病因，而内热是消渴的主要病机。《素问·奇病论》说：“此肥美之所发也，此人必数食甘美而多肥也”，食甘则中气缓而善留，食肥则阳气滞而不达，日久脾胃受损致“中满”“内热”，阳明胃热上蒸于肺，肺失敷布，故形成消渴肺胃热盛伤津之候。白虎加人参汤由医圣张仲景创立，此方用白虎汤清热生津，又因热盛耗气伤阴，加人参以增强益气生津之力，此为阳明热盛、气阴两伤证治而设，在临床备受推崇。本课题组前期研究发现，高脂喂养的T2DM MKR小鼠存在炎症通路的激活，白虎加人参汤对小鼠的血糖及炎症具有调节作用，然而其作用机理目前尚不明确[11]。网络药理学是药物系统性研究的新兴学科，其能够从成分-靶点-通路-疾病的角度系统阐明药物发挥临床疗效的作用机制，因其具有整体性等特点，与中医药的整体观等基本理论趋于一致，近年来有关中药复方治疗T2DM的有效成分及作用机制的网络药理学研究也常见报道[12-15]。因此本研究采用网络药理学结合动物实验验证探讨白虎加人参汤治疗T2DM的分子靶点及作用机制，为深入研究白虎加人参汤治疗T2DM奠定了良好的理论基础。

2 研究思路与方法

本研究采用网络药理学结合动物实验验证探讨白虎加人参汤治疗T2DM的分子靶点及作用机制。首先应用TCMSP、TCMID和PubChem数据库获取白虎加人参汤的化学活性成分及相关靶点信息，在GEO数据库获得影响T2DM的差异基因，并与白虎人参汤靶点交集获取共同靶点。运用STRING V11.0数据库进行蛋白互作分析并获取蛋白互作网络图及核心靶点。通过DAVID 6.8分析平台，获得GO功能注释结果及KEGG通路富集结果，分析通路相关基因及功能，并通过实验研究进一步验证，研究流程图见图1。

图1 研究流程图

3 研究与分析

3.1 材料与方法

3.1.1 白虎加人参汤各中药活性成分及作用靶点收集与筛选

通 过TCMSP（https://tcmspw.com/tcmsp.php）和TCMID（http://www.megabionet.org/tcmid/）数据库，在线检索白虎加人参汤中“知母”、“人参”、“粳米”、“炙甘草”、“石膏”的化学成分。并设置口服生物利用度（Oral bioavailability，OB）≥30%，类药性（DL）≥0.18为限定条件，筛选出各中药的活性成分。在PubChem数据库（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov）中将收集到的活性成分进行确证，将其标准化并下载Canonical SMILES序列，前往SwissTargetPrediction数据库（http://www.swisstargetpredicTion.ch/）进行药物靶点预测，将获得的靶点在Uniprot数据库（https://www.uniprot.org/）校对，剔除重复靶点。

3.1.2 T2DM相关靶点的获取与整理

从GEO数据库下载“Type II diabetes mellitus”相关芯片“GSE29221”信息，借助GEO2R进行分析获得影响T2DM的差异基因，并与白虎加人参汤靶点取交集获得共同靶点构建韦恩图。

3.1.3 蛋白相互作用（protein-protein interaction，PPI）网络构建与分析

将“1.2项下”获取的共同蛋白靶点导入String V11.0数据库（https://string-db.org/）进行蛋白互作分析，获取蛋白互作网络图并进行数据分析。

3.1.4 成分-共同靶点网络的构建

将药物疾病共同靶点导入Cytoscape3.8.0构建“成分-靶点”网络图。使用Cytoscape3.8.0中网络分析（Network analyzer）功能，根据节点连接度（Degree）的大小获取白虎加人参汤治疗T2DM的核心成分。

3.1.5 基因本体（gene ontology，GO）富集分析与京都基因与基因组百科全书（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路分析

将“1.2项下”获取的共同靶点导入DAVID 6.8平台（https://david.ncifcrf.gov/summary.jsp）进行GO功能与KEGG通路分析，并利用Reactome数据库（https://reactome.org/）进行相关机制分析。

3.1.6 成分-共同靶点-通路调控网络的构建

对预测到共同靶点的成分、共同靶点、KEGG通路分析结果进行梳理，导入Cytoscape3.8.0软件，以构建成分-共同靶点-通路调控网络图。

3.2 实验验证

3.2.1 动物

使用8周龄雄性MKR小鼠。MKR小鼠是一种胰岛素抵抗动物模型，其骨骼肌特异表达显性负性IGF受体，会引起肌肉胰岛素抵抗，在8周龄时小鼠会出现胰岛β细胞衰竭与糖尿病，是较好的T2DM转基因动物模型[16]。对照组采用同周龄雄性的FVB小鼠（SCXK（京）2016-0006）。小鼠均在湖南中医药大学SPF级实验动物中心适宜环境中饲养。

3.2.2 药物

白虎加人参汤组方中药购于湖南中医药大学第一附属医院中药房，石膏50 g、知母18 g、人参10 g、粳米9g、炙甘草6 g，由湖南中医药大学药学院吴勇军副教授鉴定，均符合《中国药典》2020年版标准。将各味中药放于砂锅中并用蒸馏水744 mL浸泡30 min，加热煮沸后，转用文火煎煮20 min，纱布过滤药液，药渣再加蒸馏水465 mL煎煮25 min并过滤，将两次煎煮的滤液浓缩至含生药量1 g·mL-1的药液，放4℃冰箱保存备用。

3.2.3 主要仪器与试剂

仪器：RT-6100酶标分析仪、台式冷冻离心机、电泳仪、荧光定量RCP仪。试剂：小鼠白介素-6（Interleukin-6，IL-6）、IL-1β、肿瘤坏死因子-α（Tumor necrosis factor-α，TNF-α）ELISA检测试剂盒由上海酶联生物科技有限公司提供；核因子κB（nuclear factor kappa B，NF-κB）抗 体、磷 脂 酰 肌 醇3-激 酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）抗体、蛋白激酶B（protein kinase B，AKT）抗体（英国Abcam公司）；逆转录试剂盒（中国北京康为世纪公司）。

3.2.4 糖尿病小鼠模型的制备及分组

参考本课题组前期实验研究[11]，选取MKR小鼠24只，随机分为模型组、白虎加人参汤高剂量组、白虎加人参汤低剂量组，各8只。对照组采用8只同龄同性别FVB小鼠。小鼠灌胃剂量通过体表面积的等效剂量系数折算法换算，白虎加人参汤低剂量组给予13.5 g/kg/天白药液灌胃；高剂量组给予56 g/kg/天白虎加人参汤药液灌胃。模型组、空白组以等体积蒸馏水灌胃。灌胃容量为0.02 mL/g/天，每天1次，连续4周。

3.2.5 空腹血糖及血清炎症因子指标的测定

小鼠禁食不禁水8 h后，先用一次性酒精棉片消毒小鼠尾尖部，待干后，用采血针轻刺小鼠尾梢取血样，测定空腹血糖（fasting blood glucose，FBG）值；于眼球取血留取血样，在4℃环境下，离心10 min得到血清。采用ELISA法测量MKR小鼠血清中IL-6、IL-1β、TNF-α水平。

3.2.6 蛋白质印迹法检测胰腺组织中PI3K、AKT、NF-κB的表达

剪取胰腺组织标本约25mg，加入RIPA蛋白裂解液将组织研磨匀浆，冰上裂解10 min后，4℃，12000 rpm离心15 min取上清液，采用BCA法测定蛋白浓度。加入50 µL 5*loading buffer混匀，沸水煮5 min。制备10%分离胶和4.8%浓缩胶。根据蛋白定量结果，第一孔点入marker 2µL，其它每空上样10µL已变性蛋白。然后开始电泳，电泳恒定电压为75V，时间为130 min。待溴酚蓝电泳至胶底部时终止电泳。随后以300 mA恒定电流，NF-KB约85 min、PI3K约130 min、AKT约75 min，β-Tubulin约75 min进行转模。随后将膜浸入至采用1×PBST缓冲液配制5%脱脂奶粉而成的封闭缓冲液中，放置60 min，4℃过夜，次日再放在室温下30 min进行封闭。加入一抗稀释液兔源AKT（1:10000）、PI3K（1:1000）、NF-κB（1:2000）、β-Tubulin（1:5000）室温孵育90 min。再加入HRP标记的山羊抗鼠IgG二抗（1:6000），室温孵育90 min。使用ECL化学发光液与膜孵育1 min，用滤纸吸尽液体，在成像系统仪里面拍照。采用quantity one专业灰度分析软件进行分析，以目的蛋白与内参的灰度值的比值作为蛋白的表达值进行统计分析。

3.2.7 RT-qPCR检测胰腺组织中PI3K、AKT、NF-κB mRNA相对表达量

按Trizol试剂盒说明书提取胰腺组织总RNA，在260 nm与280 nm处测其吸光度值，计算总RNA浓度跟纯度，以组织总RAN为模板，逆转录cDNA，进行PCR反应，由上海生工生物工程有限公司合成引物序列，内参基因选β-Tubulin。引物序列如下：PI3K：正向引物5’-GTCCGTCCTGGAGAACTTGG’，反向引物5’-TGAGGCGTTTCTGGATTGC-3’，片段长度152 bp；AKT：正 向 引 物5’-CGCCTGCCCTTCTACAACCAG-3’，反向引物5’-GCATGATCTCCTTGGCATCCTC-3’，片 段 长 度175 bp；NF-κB：正 向 引 物5’-TAGCCAGCGAATCCAGACCAACA-3’；反向引物5’-TGGGTCCCGCACTGTCACCT-3’，片段长度115bp；β -Tubulin： 正 向 引 物 5’-GTGTGGATTCTGTGGAAGGC-3’；反 向 引 物5’-ATGAAAGCACACATTGCCAC-3’，片段长度155 bp。使用SYBR法进行实时定量，扩增程序为95℃10 min，95℃15 s，60℃30 s共40个循环。用2-ΔΔCt方法计算各组小鼠胰腺PI3K、AKT、NF-κB mRNA相对表达水平。

3.2.8 统计学分析

使用SPSS 21.0软件进行数据统计分析，计量资料以±s，组间比较采用单因素方差分析，以P＜0.05表示差异具有统计学意义。

3.3 结果

3.3.1 白虎加人参汤活性成分与作用靶点

从TCMSP数据库和TCMID数据库获得药物有效成分：知母159个、甘草245个、粳米29个、人参302个、石膏1个，汇总剔除重复后共721个，以OB≥30%，DL≥0.18筛选并剔除重复后获得142个候选成分，其中可预测到靶点的101个，以其预测作用靶点汇总并删除重复后共获得880个。

3.3.2 T2DM相关靶点

GEO数据库芯片“GSE29221”记载的是亚洲人的II型糖尿病相关基因表达谱，芯片数据质量良好，分析获得差异基因1229个，与白虎人参汤作用靶点进行比对获得共同靶点70个（图2）。

图2 GSE29221芯片信息（a,b,c）和药物靶点与疾病差异基因的Veen图（d）

3.3.3 蛋白互作网络分析结果

将2.2获得的上调基因与下调基因共导入String V11.0数据库进行蛋白互作分析并获取可视化图形与数据结果，可见节点间不同颜色连线的数量差异（图3）。靶点前十位分别为：VEGFA、FYN、AR、ABL1、PDGFRB、ITGAV、JAK1、TGFBR2、PTK2、EZR。

图3 蛋白互作分析图

3.3.4 成分-共同靶点网络的构建及核心成分的获取

使用Cytoscape3.8.0软件构建“成分-靶点”可视化网络图，分析发现菜豆异黄烷Phaseolinisoflavan、异甘草黄酮醇Isolicoflavonol、1-甲氧基菜豆啶素1-Methoxyphaseollidin、苏齐内酯suchilactone、异槲皮酚（Isotrifoliol）这5种成分的度值均大于2倍的平均degree值，而度值越大说明这些成分与靶点的关联数量越多，因此可以推测这些成分是白虎加人参汤治疗T2DM的核心成分。

3.3.5 GO富集分析与KEGG通路富集分析

利用DAVID 6.8分析平台进行富集分析，GO功能分析得到基因生物过程（biological process，BP）101条，其主要涉及蛋白质磷酸化、正向调节细胞增殖、信号转导等生物过程；细胞组成（cell composition，CC）27条，主要参与胞质、细胞外来体、粘着斑等细胞组成；分子功能（molecular function，MF）26条，主要参与受体结合、ATP结合、胰岛素样生长因子I结合等分子功能；根据PValue进行排序后取前10进行可视化（图4）。通过KEGG通路富集分析发现，其共同靶点主要与癌症、MAPK、PI3K-AKT等信号通路相关（图5）。Reactome数据库注释发现共同靶点主要涉及信号转导、疾病、免疫系统等诸多生物机制（图6）。由此可见白虎加人参汤可通过多个生物机制达到治疗T2DM的效果。

图4 GO功能分析结果

图5 KEGG通路分析结果

图6 共同靶点的机制分析结果

3.3.6 成分-共同靶点-通路调控网络的构建

借助Cytoscape 3.8.0软件将预测获得的共同靶点的成分、共同靶点与共同靶点相关通路构建调控网络（图7）。

图7 白虎人参汤治疗II型糖尿病的成分-靶点-通路调控网络

3.3.7 白虎加人参汤对MKR小鼠空腹血糖的影响

与对照组比较，模型组MKR小鼠FBG水平显著上升（P＜0.01）；与模型组比较，白虎加人参汤高剂量组和低剂量组小鼠FBG水平均显著下降（P＜0.01），且高剂量组小鼠FBG水平显著低于低剂量组（P＜0.01）（图8）。

图8 白虎加人参汤对糖尿病MKR小鼠FBG的影响（xˉ±s，n=8）

3.3.8 白虎加人参汤对MKR小鼠血清IL-6、IL-1β和TNF-α水平的影响

与对照组比较，模型组MKR小鼠血清IL-6、IL-1β及TNF-α水平均显著上升（P＜0.01）；与模型组比较，白虎加人参汤高剂量组、低剂量组小鼠血清IL-6、IL-1β和TNF-α水平均显著降低（P＜0.05，P＜0.01），且高剂量组小鼠血清IL-6、IL-1β和TNF-α水平显著低于低剂量组（P＜0.01）（图9）。

图9 白虎加人参汤对糖尿病MKR小鼠血清中IL-6、IL-1β和TNF-α水平的影响（xˉ±s，n=8）

3.3.9 白虎加人参汤对PI3K/AKT信号通路中PI3K、AKT和NF-κB蛋白表达的影响

与对照组比较，模型组MKR小鼠胰腺PI3K、AKT及NF-κB蛋白表达水平均显著上升（P＜0.01）；与模型组比较，白虎加人参汤高剂量组和低剂量组小鼠胰腺PI3K、AKT及NF-κB蛋白表达水平均显著下降（P＜0.01），其中白虎加人参汤高剂量组的NF-κB水平显著低于低剂量组（P＜0.01）（图10-图11）。

图10 各组小鼠胰腺组织的PI3K/AKT信号通路蛋白表达电泳分析

图11 白虎加人参汤对糖尿病MKR小鼠胰腺组织PI3K、AKT和NF-κB蛋白表达的影响（xˉ±s，n=8）

3.3.10 白虎加人参汤对MKR小鼠胰腺组织PI3K、AKT和NF-κB mRNA表达的影响

与对照组比较，模型组MKR小鼠胰腺PI3K、AKT和NF-κB mRNA表达水平均显著上升（P＜0.01）；与模型组比较，白虎加人参汤高剂量组和低剂量组小鼠胰腺PI3K、AKT和NF-κB mRNA表达水平均显著下降（P＜0.01），其中白虎加人参汤高剂量组的NF-κB mRNA表达水平显著低于低剂量组（P＜0.01）（图12）。

图12 白虎加人参汤对糖尿病MKR小鼠胰腺组织中PI3K、AKT和NF-κB mRNA表达的影响（xˉ±s，n=8）

4 讨论

T2DM的发生发展与长期存在的炎症反应、氧化应激及糖脂代谢失调密切相关[17-18]。《金匮要略》载：“寸口脉浮而迟，……劳则营气竭。”寸口脉即肺脉，主上焦病变，浮主阳虚气浮，是卫气亏虚之征；迟主营血不足，血脉不充，阳虚气浮不敛，营虚燥热内生，气阴两虚而形成消渴；又曰：“渴欲饮水，口干舌燥者，白虎加人参汤主之”。消渴发病可见口干舌燥、烦渴多饮、神疲乏力等症状，多因肺胃热盛、耗气伤津所致，属后世所说“上消”之畴。白虎加人参汤中石膏辛寒质重，善清透气热；知母苦寒滑润，善泻火滋阴，人参气阴双补，粳米护胃理气，甘草甘缓生津，调和诸药，全方共奏清热益气，生津止渴之功，组方配伍契合消渴病机，广泛应用于T2DM临床治疗。临床研究表明西医常规治疗的基础上加服白虎加人参汤可有效改善T2DM患者糖脂代谢指标、炎症因子和氧化应激水平[19]，因此，运用白虎加人参汤治疗T2DM有坚实的理论和临床实践基础。

本研究运用网络药理学结合动物实验验证关键通路的方法，从有效成分、蛋白靶点和通路等方面综合探索评价白虎加人参汤治疗T2DM的作用效果。对白虎加人参汤的活性成分和T2DM相应的靶标进行收集与筛选，得到符合标准的有70个。进一步构建成分-共同靶点网络图发现异槲皮酚、菜豆异黄烷、异甘草黄酮醇、1-甲氧基菜豆啶素、苏齐内酯这5种活性成分与治疗T2DM相关性较高。从文献报道及实验研究总结发现，这些有效成分主要与调节机体内环境稳态，改善糖脂代谢、氧化应激及炎症反应等机制密切相关。如异甘草黄酮醇可以激活HepG2细胞内CYP3A4和A549细胞内Nrf-2的表达，促进有毒物质在机体内的排泄，起到减毒从而达到维持内环境稳态的作用[20]。有研究证明异槲皮酚可抑制脂多糖诱导的NF-κB的活化从而下调IL-1β、IL-6等促炎因子及细胞内活性氧的水平[21]。

本研究通过PPI网络分析可知，血管内皮生长因子A（vascular endothelial growth factor A，VEGFA）、非受体酪氨酸激酶（tyrosine kinase Fyn，FYN）、雄激素受体（androgen receptor，AR）、酪氨酸蛋白激酶（tyrosineprotein kinase ABL1，ABL1）、血小板衍生生长因子受体（platelet-derived growth factor receptor，PDGFRB）、整合素αv（integrinαv，ITGAV）、酪氨酸激酶1（Janus kinase 1，JAK1）、转化生长因子B受体-2（recombinant transforming growth factor beta receptorⅡ，TGFBR2）、蛋白酪氨酸激酶（protein tyrosine kinase，PTK2）、细胞膜骨架连接蛋白埃兹蛋白（ezrin，EZR）这10个蛋白靶点靠前，这说明白虎加人参汤的活性成分与这些蛋白靶点具有较高的结合活性。VEGFA是一种促血管生成因子。Agudo J等在成年小鼠的胰岛中发现VEGFA的过度表达可诱导胰岛血管过度增生、形态改变和促炎细胞因子的产生，进而导致了胰岛素分泌受损、β细胞减少和高血糖发生[22]。Fyn是Src激酶家族（Src family kinases，SFK）中的一员，研究表明将糖尿病小鼠的Fyn基因敲除，能改善外周组织胰岛素敏感性及糖尿病小鼠的葡萄糖耐量[23-24]。AR是核受体超家族的成员，能介导靶基因转录，在抵制肥胖、抑制机体产生胰岛素抵抗方面发挥重要作用[25]。C-ABL1具有酪氨酸激酶活性,参与调节细胞的增殖和存活、应激反应和DNA损伤、细胞迁移、侵袭粘附及凋亡。研究表明，糖尿病小鼠心肌细胞c-Al表达上调，当特异性抑制c-Abl表达可预防动脉粥样硬化病变的发展并减少心肌损伤[26]。以上也证实了通过PPI网络所筛选的靶点蛋白的确与T2DM的发生发展密切相关。因此，VEGFA、FYN、AR、ABL1、PDGFRB、ITGAV、JAK1、TGFBR2、PTK2、EZR可能为白虎加人参汤治疗T2DM的关键靶点蛋白。

从GO功能富集结果分析可知，GO生物注释中细胞组分有胞质、细胞外来体、粘着斑等，存在受体结合等分子功能，主要涉及蛋白质磷酸化，蛋白质磷酸化是调节和控制蛋白质活力和功能的最基本、最普遍，也是最重要的机制。再者是对细胞的增殖进行正向调节，以及发挥信号转导等生物学作用，白虎加人参汤可能正是通过此方式发挥作用。KEGG分析发现其共同靶点主要与癌症、PI3K/AKT、MAPK等信号通路之间存在着相关性。有研究表明，DM与肝癌、胰腺癌等多种恶性肿瘤的高发病率与高死亡率之间存在着密切的相关性，高糖状态、高胰岛素血症、胰岛素生长因子-1、氧化应激、炎症因子及类固醇激素失调等共同促进了糖尿病患者发生恶性肿瘤的进展[27]。MAPK信号通路包括p38 MAPK通路、JNK通路及ERK通路，是哺乳动物细胞内介导细胞反应的重要信号系统，参与调节着细胞的生长及凋亡等多种过程。研究发现，MAPK信号通路与DM的糖脂代谢、氧化应激和炎症反应控制之间存在着密切的相关性[28-29]。

研究表明，PI3K/Akt途径是胰岛素作用的主要信号通路，PI3K是调节糖代谢的关键蛋白，位于其下游的信号分子Akt是重要的蛋白激酶[30]。PI3K/Akt信号通路的异常对DM病情进展影响较大，其在介导机体糖脂代谢、蛋白合成等方面效果显著[31-33]。研究表明，当PI3K/AKT的调节功能受影响时，则会发生肥胖等病。此时有效抑制PI3K/Akt信号通路，则是一种抵抗肥胖、逆转疾病负面影响的安全有效的干预措施[34]。研究表明糖尿病引起的高糖毒性环境、氧化应激等病理因素能够过度激活PI3K/Akt信号通路，此时要治疗T2DM则应当抑制过度激活的PI3K/AKT信号通路[35]。研究发现，PI3K/Akt信号能够调节细胞增殖等过程。且PI3K在胰岛素信号传导中发挥着重要作用[36-37]。龚又明等[38]研究小檗碱对HepG2胰岛素抵抗细胞PI3K/AKT1/GLUT1信号通路的调控作用机制发现，小檗碱通过使HepG2细胞中的PI3K p85表达上调，Akt1蛋白表达下调，能提高细胞的葡萄糖代谢能力，改善胰岛素抵抗。PI3K/Akt信号通路在T2DM的炎症反应过程中起着关键的作用。PI3K/Akt信号通路下游的重要效应因子是NF-κB，NF-κB是多种信号转导途径的汇聚点，也是炎症启动和调节的关键核因子，NF-κB活化后可诱导众多炎性因子如TNF-α、IL-6和IL-1β等的表达，引起炎性反应，而产生的IL-1β和TNF-α等又能使得更多NF-κB活化，从而加重T2DM的发生发展[39-40]。

本课题组前期研究发现白虎加人参汤能够有效降低T2DM MKR小鼠血糖及炎症水平，但其降糖和调节炎症机制尚未完全阐明[11]。本研究通过网络药理学KEGG通路分析发现PI3K/Akt信号通路是白虎加人参汤干预T2DM的重要信号通路之一，基于此推进动物实验进行验证。通过动物实验发现，白虎加人参汤能下调网络药理学预测的PI3K/AKT通路中过度激活的PI3K、Akt、NF-κB蛋白表达，降低PI3K、Akt、NF-κB mRNA表达量，降低MKR小鼠FBG水平及血清中IL-6、IL-1β、TNF-α炎性因子水平，产生降糖及抗炎活性而具有治疗T2DM的作用，进一步证明网络药理学预测结果和实验结果的一致性。

5 结论

综上所述，本研究利用网络药理学明确了白虎加人参汤有效成分及其干预T2DM的潜在作用靶点，通过GO富集分析和KEGG通路分析了解了白虎加人参汤治疗T2DM的复杂生物学过程及其调控的信号通路，并对其关键的作用通路进行了实验验证，揭示了白虎加人参汤治疗T2DM具有多成分、多靶点、多通路的作用特点，实验证实了白虎加人参汤能够下调PI3K/AKT通路相关蛋白表达及mRNA相对表达量，降低MKR小鼠血糖和血清炎症因子水平，验证了网络药理学结果，为深入研究白虎加人参汤治疗T2DM提供了依据。本研究尚存在以下局限性：首先，本文涉及的靶点、信号通路较多，需要注意的是，网络药理学是依据现有数据库和已有实验数据进行网络的建模，由于原始实验数据、图谱信息来源于不同的实验条件，故大多实验存在一定的假阳性率，已经评价的小分子化合物及其作用靶点数量均有限；其次，中药在煎煮时会发生复杂的化学反应，本研究未将白虎加人参汤煎煮后的化学成分以及药物在体内的代谢物纳入分析。