基于Nrf2/Keap1/HO-1通路的淫羊藿素对精索静脉曲张雄性大鼠生精功能的影响

黄雅平 林文东 丁小明

精索静脉曲张是目前临床中较为常见的男科疾病，好发于青壮年，主要指精索内静脉伸长、扩张、迂曲。有调查结果显示，精索静脉曲张的临床发病率10%～15%，其主要发病部位为左侧，约30%以上男性不育症由精索静脉曲张诱发[1]。研究表明，精索静脉曲张是目前临床中导致患者出现附睾及睾丸功能障碍的主要因素，并可能诱发患者出现生精功能异常[2]。依照传统中医理论，精索静脉曲张性不育症患者常采用补肾祛瘀法进行治疗，精索静脉曲张致不育症主要与肾虚血瘀关系密切，导致患者出现肾精亏虚、营气不从[3]。淫羊藿是目前广泛应用的补肾药，其应用历史悠久，又称为仙灵脾，现代药理学研究表明其具有明确的抗肿瘤、抗衰老作用。淫羊藿能有效促进睾丸分泌睾酮，在促进小鼠精囊及附睾发育中发挥重要作用，具有明确的性激素样效应，可作为治疗精索静脉曲张的潜在药物[4]。本研究通过构建雄性大鼠精索静脉曲张动物模型，并对该模型进行研究，分析基于Nrf2/Keap1/HO-1通路淫羊藿素对精索静脉曲张雄性大鼠生精功能的影响。

1 材料与方法

1.1 动物

选择青春期SPF级雄性大鼠60只作为研究对象，大鼠体重（170±10）g，6周龄，所有大鼠均购自北京维通利华实验动物技术有限公司，饲养于泉州医学高等专科学校屏障系统动物房，许可证号SYXK（闽）2016-0001。所有大鼠采用随机数字表法分为空白对照组、模型组、阳性对照组、淫羊藿素低剂量组、中剂量组、高剂量组，每组10只。按实验要求先进行适应性饲养，再进行后续实验。饮食饮水一切按要求正常给予。

1.2 造模方法

本研究中模型组、阳性对照组、淫羊藿素低剂量组、中剂量组、高剂量组均构建精索静脉曲张大鼠模型，采用左肾静脉部分结扎法构建模型，腹腔注射2%戊巴比妥钠麻醉，随后于下腹部正中切开皮肤，打开腹腔，充分暴露精索内静脉、左侧肾静脉、下腔静脉及肾上腺静脉。将大鼠肾上腺静脉内侧部分左肾静脉段和左侧精索静脉仔细游离并使用4-0丝线穿过并备用，使用0.65 mm光滑金属杆与该段左肾静脉上平行结扎，结扎完成后小心拔出金属杆，复通静脉构建左肾静脉狭窄模型，后分离并结扎左髂总静脉与精索内静脉间交通支，后关腹缝合切口。空白对照组使用假手术方案处理，参照模型组进行分离静脉但不做结扎处理，其他操作同模型组。术后6周麻醉大鼠，再次开腹观察大鼠精索内静脉及双肾状态，较右侧精索内静脉左侧明显扩张迂曲且左肾无萎缩。模型制备不成功大鼠则清除出实验，最终模型组、阳性对照组、淫羊藿素低剂量组、中剂量组、高剂量组每组入组8只大鼠。所有大鼠均适应性喂养一周后开始给药治疗。

1.3 干预方法

空白对照组、模型组按实验方案灌胃（2 ml/d），低剂量组、中剂量组、高剂量组分别淫羊藿素灌胃75 mg/kg、100 mg/kg和125 mg/kg，淫羊藿素为浅黄色粉末，购自西安小草植物科技有限公司，阳性对照组采用迈之灵片（德国礼达大药厂，注册证号ZJ20140002）54 mg/kg灌胃治疗，各组大鼠每日灌胃干预一次，持续给药干预8周后再进行后续操作。

1.4 观察指标

各组均给药8周后处死大鼠，摘取大鼠左侧睾丸、附睾，称重并计算脏器指数，检测精子浓度、总活率、前向运动精子、精子头侧摆幅度（ALH）、精子曲线速度（VCL）、精子直线速度（VSL）、平均路径速度（VAP）；检测左侧附睾生精细胞凋亡情况，大鼠睾丸组织超氧化物酶歧化酶（SOD）、乳酸脱氢酶同工酶（LDH-X）及丙二醛（MDA）水平，Western Blot检测睾丸组织中Nrf2、Keap1和HO-1蛋白表达，逆转录聚合酶链反应法（RT-PCR）检测睾丸组织中Nrf2、Keap1和HO-1的mRNA表达。

1.5 统计学分析

采用SPSS 20.0统计软件进行数据分析，计量资料以±s表示行方差检验分析，利用LSD-t检验分析两组间计量资料差异，计数资料以百分率表示，组间比较采用χ2检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 左侧睾丸及附睾指数

阳性对照组、低剂量组、中剂量组、高剂量组大鼠睾丸指数及附睾指数明显高于模型组（P＜0.05），阳性对照组和淫羊藿素低、中、高三组睾丸指数、附睾指数比较差异无统计学意义（P＞0.05）。见表1。

表1 6组大鼠左侧睾丸及附睾指数比较(mg/g,±s)

表1 6组大鼠左侧睾丸及附睾指数比较(mg/g,±s)

组别 只数 睾丸指数 附睾指数空白对照组 10 3.86±0.21 1.51±0.11模型组 8 3.02±0.12 1.08±0.07阳性对照组 8 3.74±0.17 1.40±0.05低剂量组 8 3.61±0.15 1.31±0.08中剂量组 8 3.73±0.09 1.42±0.06高剂量组 8 3.76±0.13 1.41±0.07

2.2 精子活动度

阳性对照组、低剂量组、中剂量组、高剂量组大鼠精子浓度、总活率、前向运动精子、ALH、VCL、VSL及VAP明显高于模型组（P＜0.05），阳性对照组、低剂量组、中剂量组、高剂量组大鼠精子浓度、总活率、前向运动精子、ALH、VCL、VSL及VAP比较差异无统计学意义（P＞0.05），低剂量组大鼠精子浓度、总活率、前向运动精子、ALH、VCL、VSL及VAP略低于阳性对照组、中剂量组、高剂量组，但差异无统计学意义（P＞0.05）。见表2。

表2 6组大鼠精子活动度比较(±s)

表2 6组大鼠精子活动度比较(±s)

组别 只数 精子浓度(M/ml)总活率(%)前向运动精子(%)VSL(mm/s)VCL(mm/s)VAP(mm/s)ALH(mm/s)空白对照组 10 81.74±4.59 70.84±5.02 52.38±4.58 29.64±1.03 49.54±3.92 40.65±2.38 2.31±0.34模型组 8 54.39±4.11 45.74±4.57 20.12±5.01 10.31±2.01 27.43±3.84 17.21±3.12 1.23±0.29阳性对照组 8 66.49±3.98 62.38±4.88 40.84±4.43 26.48±1.88 42.48±2.19 36.73±2.99 2.08±0.27低剂量组 8 61.92±5.02 58.34±5.12 38.49±5.12 23.31±1.73 39.28±2.99 34.01±2.74 1.93±0.30中剂量组 8 67.39±4.38 61.21±4.92 41.21±5.03 25.49±1.69 41.99±3.01 36.04±3.41 2.03±0.33高剂量组 8 68.41±4.47 62.19±4.79 42.19±5.47 26.03±1.64 42.84±2.74 37.03±2.55 2.17±0.28

2.3 左侧附睾生精细胞凋亡情况

阳性对照组、低剂量组、中剂量组、高剂量组大鼠附睾生精细胞凋亡指数明显低于模型组（P＜0.05），阳性对照组、低剂量组、中剂量组、高剂量组大鼠附睾生精细胞凋亡指数比较差异无统计学意义（P＞0.05）。见表3。

表3 6组大鼠左侧附睾生精细胞凋亡情况比较(±s)

表3 6组大鼠左侧附睾生精细胞凋亡情况比较(±s)

组别 只数 附睾生精细胞凋亡指数空白对照组 10 1.54±0.32模型组 8 12.47±1.02阳性对照组 8 2.70±0.28低剂量组 8 3.28±0.19中剂量组 8 2.74±0.24高剂量组 8 2.56±0.21

2.4 睾丸组织指标检测结果

阳性对照组、低剂量组、中剂量组、高剂量组大鼠SOD、LDH-X明显高于模型组，MDA明显低于模型组，差异有统计学意义（P＜0.05），阳性对照组、低剂量组、中剂量组、高剂量组大鼠SOD、LDH-X、MDA比较差异无统计学意义（P＞0.05）。见表4。

表4 6组大鼠睾丸组织指标检测结果(U/L,±s)

表4 6组大鼠睾丸组织指标检测结果(U/L,±s)

组别 只数 LDH-X SOD MDA空白对照组 10 75.85±4.39 96.04±5.43 7.84±1.29模型组 8 43.92±3.99 63.29±7.65 19.68±4.30阳性对照组 8 67.48±5.01 90.09±4.95 8.79±3.88低剂量组 8 65.37±4.38 87.94±5.01 9.32±4.19中剂量组 8 67.01±4.25 89.99±4.83 8.92±4.27高剂量组 8 68.74±3.49 91.32±4.94 8.57±3.94

2.5 Nrf2、Keap1和HO-1蛋白表达水平检测结果

阳性对照组、低剂量组、中剂量组、高剂量组大鼠Nrf2、Keap1和HO-1蛋白显著高于模型组（P＜0.05），阳性对照组、低剂量组、中剂量组、高剂量组大鼠Nrf2、Keap1和HO-1蛋白比较差异无统计学意义（P＞0.05）。见表5。

表5 6组大鼠Nrf2、Keap1和HO-1蛋白表达水平检测结果(±s)

表5 6组大鼠Nrf2、Keap1和HO-1蛋白表达水平检测结果(±s)

组别 只数 Nrf2/β-actin Keap1/β-actin HO-1/β-actin空白对照组 10 0.67±0.09 0.65±0.08 0.78±0.06模型组 8 0.20±0.04 0.24±0.03 0.31±0.04阳性对照组 8 0.61±0.10 0.63±0.09 0.71±0.05低剂量组 8 0.55±0.07 0.56±0.08 0.66±0.08中剂量组 8 0.59±0.08 0.60±0.09 0.70±0.06高剂量组 8 0.62±0.06 0.64±0.07 0.72±0.07

2.6 Nrf2、Keap1和HO-1 mRNA表达水平检测结果

阳性对照组、低剂量组、中剂量组、高剂量组大鼠Nrf2、Keap1和HO-1 mRNA明显高于模型组（P＜0.05），阳性对照组、低剂量组、中剂量组、高剂量组大鼠Nrf2、Keap1和HO-1 mRNA比较差异无统计学意义（P＞0.05）。见表6。

表6 6组大鼠Nrf2、Keap1和HO-1 mRNA表达水平检测结果(±s)

表6 6组大鼠Nrf2、Keap1和HO-1 mRNA表达水平检测结果(±s)

组别 只数 Nrf2/β-actin Keap1/β-actin HO-1/β-actin空白对照组 10 0.56±0.04 0.67±0.08 0.78±0.12模型组 8 0.21±0.06 0.28±0.05 0.36±0.07阳性对照组 8 0.53±0.04 0.58±0.06 0.66±0.10低剂量组 8 0.46±0.03 0.50±0.07 0.61±0.11中剂量组 8 0.51±0.05 0.57±0.07 0.65±0.12高剂量组 8 0.55±0.04 0.61±0.10 0.71±0.13

3 讨论

精索静脉曲张是目前临床中导致男性出现不育症的重要病因，且WHO最新数据显示其已成为导致男性不育的主要诱因[5]。有学者提出的一种构建方案是缩窄大鼠左侧精索静脉汇入左肾静脉处，是目前成功率高的动物模型，在基础研究中得以广泛应用，为男性不育症的研究提供了实验依据[6]。还有学者[7-8]指出，利用缩窄大鼠左侧精索静脉汇入左肾静脉处的方案进行干预发现，左侧附睾组织出现较明显病变状态，精子数量明显减少，且排列紊乱。而且大部分生理细胞内还存在空泡情况，消融和固缩现象等，出现亚细胞结构消失，如细胞膜、细胞核、线粒体、内质网及溶酶体消失，同样的情况还在生精细胞中出现。结果表明采用缩窄大鼠左侧精索静脉汇入左肾静脉处的方案可造成大鼠附睾组织损伤，因此本研究拟选择该模型进行后续研究。

淫羊藿是目前广泛应用的传统壮阳补肾中药，也是目前生殖内分泌疾病的中医中药治疗中常用药物[9]。淫羊藿具有补腰膝、益精气、坚筋骨、强心力功效，并具有较强的抗氧化作用。研究表明，采用生精素片等含淫羊藿中药制剂治疗137例精索静脉曲张诱发的生精功能异常患者，患者治疗一年半内受孕率达60%以上[10]。研究表明，幼年小鼠采用淫羊藿干预会显著调节其生殖内分泌功能，有效促进幼年小鼠附睾及精囊的发育[11]。利用淫羊藿干预可有效调节大鼠睾丸内睾酮合成及分泌，改善睾丸生精功能，并具有明确的性激素样效应，也成为目前治疗男性不育的新选择。精索静脉曲张的发病和发展机制复杂，研究认为其主要与氧化应激导致细胞凋亡、炎症等有关，其中生精细胞凋亡是目前公认的导致男性不育的细胞学基础[12]。

阳性对照组、低剂量组、中剂量组、高剂量组大鼠睾丸指数、附睾指数、精子浓度、总活率、前向运动精子、ALH、VCL、VSL、VAP及SOD、LDH-X明显高于模型组，生精细胞凋亡指数、MDA明显低于模型组。进一步分析各组大鼠组织Nrf2/Keap1/HO-1通路研究结果显示，阳性对照组、低剂量组、中剂量组、高剂量组大鼠Nrf2、Keap1和HO-1蛋白及mRNA明显高于模型组。迈之灵片是目前临床常用的治疗精索静脉曲张的药物之一，其具有增加静脉回流，降低血管通透性，增加血管弹性和张力，减轻静脉淤血症状和抗氧自由基的作用，因此本研究选择该药物作为阳性对照药，用于评估淫羊藿素的临床应用潜在价值。低、中、高剂量组与阳性对照组各指标无明显差异，表明淫羊藿素具有较高的改善精索静脉曲张雄性大鼠生精功能疗效。分析认为，Nrf2在细胞可与胞质内特异性受体Keap1结合，并失去活性[13]。HO-1体内可催化血红素生成CO、铁及胆红素，也是重要的调控基因[14]。

综上所述，采用淫羊藿素治疗精索静脉曲张，可能通过调控Nrf2/Keap1/HO-1通路有效调节雄性大鼠生精功能。