对甲酚降解菌对自闭症小鼠行为及微生物群落-肠道-脑轴影响

张文茂 陈卓 穆红香 彭赞平

自闭症为神经系统发育障碍，对患儿的社交功能造成较大不良影响，且本病在我国的发病率呈现升高的趋势，是临床控制需求极高的一类疾病。而对自闭症进行机制研究，有助于治疗靶点筛选，因此是临床研究的重点[1-2]。微生物群落-肠道-脑轴作为近年来在自闭症研究中的一个重要方面，较多研究认为肠道菌群可通过影响脑肠轴来影响中枢神经系统。有研究显示，患儿粪便中的对甲酚含量较高，且其含量与自闭症症状密切相关，而对甲酚降解菌可降解对甲酚，可通过脑肠轴进行调控，从而对自闭症实现治疗的作用[3-5]。故本研究探究对甲酚降解菌诱导自闭症小鼠行为变化及对微生物群落-肠道-脑轴的影响，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 一般材料

将2022 年1—2 月的20 只孤独症谱系障碍模型（Black and Tan Bachyuric-T+tf/J，BTBR-T+tf/J）近交系小鼠随机分为研究组（对甲酚降解菌干预组）10 只和对照组（空白质粒大肠杆菌组）10 只，其均于小鼠出生3 周断奶后进行研究，其中研究组的体质量18～22 g，平均（20.12±0.98）g；对照组的体质量18～22 g，平均（20.06±1.01）g。另选取10 只3 周昆明（Kunming，KM）小鼠为空白组，18～22 g，平均（20.16±0.96）g。三组小鼠均雌雄各半，且三组的体质量比较，差异无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。

1.2 方法

研究符合动物伦理学要求。动物饲养和操作条件依据《湖南省实验动物管理办法》和《实验动物质量管理办法》[6]要求严格执行。动物房室内温度控制18～26℃，相对湿度40%～60%。独立通气笼具饲养，按12 h 光照12 h 黑暗交替光源。垫料经高温灭菌消毒处理，饮用水为煮沸冷凉自来水，常规饲料热量为3.51 kCal/g，研究组的小鼠每2 天1 次，连续服用1 个月：1×1010cfu 新鲜培养的对甲酚降解菌；对照组每2 天1 次，连续服用1 个月：1×1010cfu 新鲜培养的空白质粒大肠杆菌。实验期间每日更换垫料（代谢笼除外），饮水喂食按实验要求。均饲养8 周。

1.3 观察指标

比较三组的行为学实验（旷场试验、理毛实验、大理石包埋实验及三箱实验）结果及微生物群落-肠道-脑轴指标[粪便活菌数、肠道组织过氧化氢酶（catalase，CAT）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）及总抗氧化能力（total antioxidant capacity，TAC）、海马组织核因子相关因子-2（NF-E2-related factor，2Nfr-2）及超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）]。

（1）旷场试验：采用边长为45 cm 的正方形敞箱进行实验，分成16 个小正方形，中间4 个小正方形为中央区域，将实验小鼠置入中央区域，采用追踪系统软件（格罗贝尔生物科技有限公司，型号：ANYmaze）对小鼠在敞箱内的移动距离、中央区域停留时间及移动速度进行统计，统计时间为5 min[7]。（2）理毛实验：将实验小鼠置入干净整洁的笼子内，统计其20 min内的理毛次数[8]。（3）大理石包埋实验：将实验小鼠置入鼠笼，鼠笼中铺设新鲜的垫料，放入直径1.5 cm 大理石弹珠，将实验小鼠放入30 min，计算被埋藏的大理石弹珠[9]。（4）三箱实验：将实验小组置于三个箱体中，三个箱体之间有活动门，实验前将小鼠放入中间箱体自由活动10 min，然后进行实验，将小鼠放入左右两个箱体，实验小鼠置入中间箱体，记录10 min，统计小鼠在每个箱体的停留及嗅探时间，进行箱体偏好系数[（小鼠箱体时间-物体箱体时间）/（小鼠箱体时间+物体箱体时间）]及嗅探时间偏好系数[（小鼠嗅探时间-物体嗅探时间）/（小鼠嗅探时间+物体嗅探时间）]的计算[10]。（5）粪便活菌数：分别在第 3、4、5、6、7 周采集小鼠粪便，采用平板活菌计数法进行粪便活菌数的检测及统计，统计项目为双歧杆菌、乳杆菌及厌氧菌总数。（6）饲养8 周后采集肠道组织及大脑组织，进行肠道组织CAT、MDA 及TAC，海马组织Nfr-2 及SOD 的检测，采用电动匀浆仪（浙江泰林生物技术股份有限公司，型号：HTY-761）制备匀浆，采用每项指标对应的试剂盒进行检测。

1.4 统计学方法

2 结果

2.1 三组的旷场实验结果比较

空白组的旷场试验显著优于研究组及对照组，研究组则显著优于对照组（P＜0.05），见表1。

表1 三组的旷场实验结果比较（）

表1 三组的旷场实验结果比较（）

注：t1、P1 为研究组与对照组比较；t2、P2 为研究组与空白组比较；t3、P3 为对照组与空白组比较。

2.2 三组的理毛实验及大理石包埋实验比较

空白组的理毛实验及大理石包埋实验显著优于研究组及对照组，研究组则显著优于对照组（P＜0.05），见表2。

表2 三组的理毛实验及大理石包埋实验比较（）

表2 三组的理毛实验及大理石包埋实验比较（）

注：t1、P1 为研究组与对照组比较；t2、P2 为研究组与空白组比较；t3、P3 为对照组与空白组比较。

2.3 三组的三箱实验比较

空白组的三箱实验显著优于研究组及对照组，研究组则显著优于对照组（P＜0.05），见表3。

表3 三组的三箱实验比较（%，）

表3 三组的三箱实验比较（%，）

注：t1、P1 为研究组与对照组比较；t2、P2 为研究组与空白组比较；t3、P3 为对照组与空白组比较。

2.4 三组的粪便活菌数比较

空白组的粪便活菌数显著高于研究组及对照组，研究组则显著高于对照组（P＜0.05），见表4。

表4 三组的粪便活菌数比较（cfu/g，）

表4 三组的粪便活菌数比较（cfu/g，）

注：t1、P1 为研究组与对照组比较；t2、P2 为研究组与空白组比较；t3、P3 为对照组与空白组比较。

2.5 三组的肠道组织CAT、MDA 及TAC 比较

空白组的肠道组织CAT 及TAC 显著高于研究组及对照组，研究组则显著高于对照组，肠道组织MDA 显著低于研究组及对照组，研究组显著低于对照组（P＜0.05），见表5。

表5 三组的肠道组织CAT、MDA 及TAC 比较（）

表5 三组的肠道组织CAT、MDA 及TAC 比较（）

注：t1、P1 为研究组与对照组比较；t2、P2 为研究组与空白组比较；t3、P3 为对照组与空白组比较。

2.6 三组的海马组织Nfr-2 及SOD 比较

空白组的海马组织SOD 显著高于研究组及对照组，研究组则显著高于对照组，Nfr-2 显著低于研究组及对照组，研究组显著低于对照组（P＜0.05），见表6。

表6 三组的海马组织Nfr-2 及SOD 比较（）

表6 三组的海马组织Nfr-2 及SOD 比较（）

注：t1、P1 为研究组与对照组比较；t2、P2 为研究组与空白组比较；t3、P3 为对照组与空白组比较。

3 讨论

临床中与自闭症相关的研究中，微生物群落-肠道-脑轴方面的研究日益增多，较多研究认为，肠道微生态的失衡可能是导致自闭症发生发展的重要原因之一，对肠道微生态失调的干预与调控可能是治疗本病的有效方式之一[12]。脑肠轴作为脑、肠之间的双相生理通信网络，肠道菌群可通过影响脑肠轴来达到影响中枢神经系统的作用，因此认为微生物介导可能会对自闭症起到一定的治疗干预作用。有研究显示[13]，自闭症患儿的肠道对甲酚含量显著升高，且其含量与自闭症症状呈正相关，因此对自闭症患儿进行治疗的过程中，通过降解对甲酚来达到调控脑肠轴的方式，对疾病进行控制与改善的研究意义较高。而对甲酚降解菌可对对甲酚起到降解的作用[14]，因此认为，对甲酚降解菌可能与自闭症起到一定的影响作用，但是相关方面的研究相对不足。

本研究结果显示，空白组小鼠的上述行为学实验结果及微生物群落-肠道-脑轴指标指标显著优于对甲酚降解菌干预及空白质粒大肠杆菌干预的小鼠，而对甲酚降解菌干预的小鼠，上述方面的检测与评估结果均显著优于空白质粒大肠杆菌干预的小鼠（P＜0.05），因此认为对甲酚降解菌诱导自闭症小鼠行为变化的优势较为突出，且可对微生物群落-肠道-脑轴相关方面的检测指标具有较好的改善作用，因此对于自闭症的治疗与改善效果较好。分析原因，对甲酚降解菌通过降解对甲酚来达到影响肠道状态的作用，进而影响到肠道菌群失衡的情况[15]，而这一与改善肠道组织CAT、MDA 及TAC 具有积极的作用，有助于调控其抗氧化失衡的情况，进而影响到脑部，表现为海马组织Nfr-2 及SOD 表达的改善，而这是其神经保护作用中的一个重要环节，而上述几个方面均有助于改善自闭症的状态[16]，因此小鼠的相关行为变化更为突出。

综上所述，研究认为对甲酚降解菌可改善自闭症小鼠的相关行为，可能为通过影响微生物群落-肠道-脑轴来达到影响疾病的目的。此文的研究结果为自闭症后期标准制定提供了借鉴内容。