牛白血病病毒的鉴定及防控

宫洪杰

(乳山市夏村镇畜牧兽医站，山东 威海 264500)

牛白血病病毒(BLV)属于逆转录病毒，主要引起牛地方流行性白血病。该病的潜伏期一般为4～5 a，临床症状不明显，为淋巴样细胞恶性增生，BLV可将自身RNA转变为DNA，在宿主基因组中以前病毒形式存在, 且大多数BLV感染牛无明显临床症状，所以容易被忽略，感染之后的奶牛泌乳量下、免疫疫功能受损、及进出口限制等问题, 严重影响到奶牛养殖业的可持续发展。本文通过设计牛白血病病毒的特异性引物，建立牛白血病病毒的诊断技术，为奶牛养殖业流行病学调查与疫情监测提供了技术支持。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 病料来源 本实验室自留的阳性全血样本，-80℃保存。

1.1.2 主要试剂 天根2×Taq PCR Mastermix 扩增试剂盒；天根DNA病毒提取试剂盒购；天根DNA MarkerI (MD101)。

1.2 方法

1.2.1 引物设计 利用NCBI网站查找牛白血病病毒基因序列，利用Primer 5.0软件设计一对特异性引物，序列为P1：5’-CCTCCCTGATCCACGTTCTG-3’，P2：5’-TTGAATGCGCAGGAAACAGC-3’，扩增片段为194bp。引物序列由上海生工合成。

1.2.2 引物验证 以实验室自留的阳性样品利用天根DNA病毒提取试剂盒提取病毒DNA，以提取的病毒DNA为模版，通过改变单一因子，对退火温度筛选最佳的扩增反应程序。在进行PCR反应参数筛选时，其他参数设定体系如下：2×Taq PCR Mastermix 12.5 μL，上、下游引物(25 pmol/L)各1.0 μL，ddH2O至20 μL。PCR反应程序： 95℃ 5 min；95℃ 45s，(52℃、54℃、56℃、58℃、60℃) 35 s，72℃30 s，共 35个循环；72℃ 10 min。电泳观察结果。

2 结果

2.1 最佳退火温度筛选

试验以自留的阳性样品DNA为模板进行PCR扩增 ，对其退火温度进行优化。结果表明，退火温度为 52～60℃时都能扩增出长约194 bp的预期片段，电泳条带明亮、清晰，非特异性条带少，具体见图1。

图1 退火温度筛选M.Marker I ;1-5退火温度分别为52℃、54℃、56℃、58℃、60℃

2.2 PCR结果

利用本实验室自留的阳性样品进行普通PCR扩增，扩增结果如图2，阴性对照没有扩增出目的片段，以阳性样品的DNA为模板扩增出了目的片段194 bp，说明该引物特异性强，可以应用于普通PCR的扩增。

图2 PCR鉴定结果

3 讨论

牛白血病最早是在19 世纪末就已经发生，于1969年科学家在患病牛的外周血液中分离到了牛白血病病毒，在20世纪70年代传入中国。该病毒的传播方式为垂直传播、水平传播，垂直传播指的是可以通过母代的胎盘传到新生代，水平传播可以分为血源性传播、分泌物性传播、接触性传播、寄生昆虫的传播、精液性传播、乳源性传播等。由于BLV 感染牛多数情况下没有明显的病变，是无症状的病毒携带者，但会出现一定程度免疫失调，影响免疫细胞，改变正常的细胞功能，引起奶牛产奶量下降、疾病发病率升高等问题，从而造成养牛业经济损失。由于没有任何临床症状，没有任何淋巴细胞数量的病变，所以要依靠实验室手段进行检测。常用于检测牛白血病的诊断方法是是抗体的血清学检测和前病毒DNA的聚合酶链反应(PCR)检测，本文采用了后者的检测方法，通过设计特异性引物对该病毒进行检测，为牛白血病的诊断提供了一种新方法。

大多数大洋洲国家和欧洲国家已经成功实施了BLV的有效根除计划，牛白血病目前在全球范围的感染率仍然很高。牛白血病感染尚无有效的治疗药物和疫苗，在防控牛白血病的上面主要是采取及时有效的防控策略来阻断该病毒的传播。低流行的率国家主要通过基因组学、血液学或血清学方法鉴定出牛白血病感染阳性动物，根据检测结果从牛群中迅速宰杀清除阳性动物，该防控策略已经被证实能在短时间内有效根除该病。高流行率的国家净化策略是通过隔离而不是扑杀牛白血病感染的阳性动物，从而来降低净化成本，主要方法是对血清学阳性动物持续进行检测，把牛白血病感染的牛群和血清学检测结果为阴性的牛群严格限定在各自的隔离区域。这种策略可以减少强制性扑杀和更替牛白血病阳性动物造成的巨大损失。实施过程要求高，但这种策略确实能有效降低牛白血病流行率，甚至可以根除该病。

在现实防控方面，养牛场应当尽量自繁自养，并减少从别场引入精液、种牛、犊牛等；必须进行引入时，要做好对引入的牛进行分区域隔离，隔离期间安排对牛的白血病抗体进行检测，对于隔离期满后没有任何症状，血液学检测正常的牛可以认为该牛为健康牛，然后才能安排与其它牛混群饲养。对整个养殖场的牛群要定期进行血清学监测，检出阳性牛的要根据其临床症状分别管理，对于出现临床症状及时淘汰，没有临床症状先进行隔离处理。平时加强消毒工作，对牛舍环境进行定期消毒和清扫可以有效减少该病发生，同时做好防蚊工作，能减少通过昆虫性传播。