HPLC多成分定量控制联合多维模式识别法的白百抗痨颗粒质量评价研究

张特，乔乐天，刘源，马亚丽，王志远

（1.信阳市第五人民医院药学部，河南 信阳 464000；2.商丘市第一人民医院药学部，河南 商丘 476100；3.河南中医药大学药学院，河南 郑州 450046）

含量测定是中药复方制剂质量控制的核心，由于中药成分繁杂、有效成分不明了、所含成分含量较低、含量测定指标选择困难、干扰成分较多，仅靠一到两个成分的检测指标有一定的局限性，因而多指标综合评价模式仍是中药质量评价的主要研究方向。化学模式识别[1]主要包括主成分分析（PCA）、聚类分析（CA）、判别分析和人工神经网络，是利用现代化分析技术分析中药复杂化学数据，再用化学计量学方法对数据进行特征提取和处理分析。PCA和CA在中药评价中应用越来越多，PCA原理是通过某种高维到低维的模式变换对多变量数据分析处理，以达到对原始数据最大程度的保留；CA是对未知分类样本在模式空间中寻找相互关联的部分，根据相似度完成归类，它和PCA都是模式识别中的常用数据统计方法，两者相辅相成。偏最小二乘法-判别分析（PLS-DA）是建立在偏最小二乘法（PLS）基础上的一种监督模式识别方法，分析结果直观、清晰，具有较高的预测精度，已在中药质量评价和控制中广泛运用[2]。

白百抗痨颗粒由白及、百部、浙贝母、薏苡仁、三七和红大戟6味药组成，具有敛肺止咳、养阴清热之功效，临床上用于肺痨引起的咳嗽、痰中带血[3]，肺结核伴咳血患者应用白百抗痨颗粒治疗可有效促进其病灶吸收，缩短其临床症状改善时间，且不会增加不良反应，安全性较高[4]。白百抗痨颗粒由6味中药材按现代工艺加工而成，所含成分繁多，作用靶点较多，白百抗痨颗粒暂未收录于中国药典，现行质量标准WS-10894（ZD-0894）-2002仅以人参皂苷Rg1为指标进行了含量测定，未检索到与检验分析相关的文献。因此，建立一个科学、便捷、合理的质量评价方法，对白百抗痨颗粒的质量进行全面准确地评价具有重要的现实意义。本实验以君药白及和百部，臣药三七，佐药红大戟为研究对象，分析这四个药材中所含的主要活性成分或代表性成分，收集共12批产品，采用HPLC法同步测定白百抗痨颗粒中三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、3-羟基巴戟醌、芦西定、贝母兰宁、山药素Ⅲ、氧化对叶百部碱、二脱氢对叶百部碱含量，首次通过多成分定量控制联合CA、PCA及PLS-DA法对其进行综合质量评价，以期为白百抗痨颗粒的整体质量控制提供科学实验数据。

1 材料

1.1 试药

对照品3-羟基巴戟醌（批号111962-202102，含量97.2%）、芦西定（批号111960-201301，含量97.2%）、三七皂苷R1（批号110745-201921，含量90.4%）、人参皂苷Rg1（批号110703-202034，含量94.0%）、人参皂苷Rb1（批号110704-202230，含量95.1%）源于中国食品药品检定研究院；贝母兰宁（批号CFS201801，含量98.0%）、山药素Ⅲ（批号CFN92689，含量95.0%）源于武汉天植生物技术有限公司；氧化对叶百部碱（批号CFS201701，含量98.0%）源于武汉天植生物技术有限公司；二去氢对叶百部碱（批号106861-40-9，含量98.0%）源于上海远慕生物科技有限公司；乙腈和磷酸为色谱纯级别，其余试剂为分析纯；白百抗痨颗粒（批号210501、210503、210702、210801、210802、210804、191102、191103、191104、200603、200604、200607，编号S1-S12，规格：每袋装15 g，购于通化卫京药业股份有限公司）。

1.2 仪器

Shimadzu LC-20A型高效液相色谱仪（日本岛津公司）；SQP型电子分析天平（德国赛多利斯公司），HU10300/40B型超声波清洗仪（上海楚定分析仪器有限公司，频率40 kHz，功率300 W）。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

Gemini-NX C18（5 μm，250 mm×4.6 mm）色谱柱，柱温30℃；检测波长：0～22 min为203 nm（检测三七皂苷R1、人参皂苷Rg1和人参皂苷Rb1）[5-12]，22～42 min为280 nm（检测3-羟基巴戟醌、芦西定、贝母兰宁和山药素Ⅲ）[13-17]，42～65 min为237 nm（检测氧化对叶百部碱和二脱氢对叶百部碱）[18-21]；流动相选用乙腈（A）-0.5%磷酸（B），流速维持1.0 mL/min进 行 梯 度 洗 脱（0～11 min，15.0%A；11～22 min，15.0%→24.0%A；22～42 min，24.0%→48.0%A；42～52 min，48.0%→55.0%A；52～65 min，55.0%→15.0%A），进样量10µL。

2.2 溶液的制备

2.2.1 混合对照品溶液的制备取三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、3-羟基巴戟醌、芦西定、贝母兰宁、山药素Ⅲ、氧化对叶百部碱、二脱氢对叶百部碱对照品适量，用70%甲醇制成质量浓度分别为1.512、0.430、0.384、0.096、0.074、0.580、1.134、0.658、0.492 mg/mL的混合对照品储备液，再将储备液用70%甲醇稀释20倍得混合对照品溶液（上述9种对照品质量浓度分别为75.60、21.50、19.20、4.80、3.70、29.00、56.70、32.90、24.60 μg/mL）。

2.2.2 供试品溶液的制备取白百抗痨颗粒，精密称定2.0 g，置25 mL量瓶中，加70%甲醇适量，超声处理30 min，放冷，70%甲醇定容，摇匀，过滤，即得。因待测成分三七皂苷R1、人参皂苷Rg1和人参皂苷Rb1为三七药效成分，3-羟基巴戟醌和芦西定为红大戟特征成分，贝母兰宁和山药素Ⅲ为白及主要成分，氧化对叶百部碱和二脱氢对叶百部碱为百部代表性成分，故按照白百抗痨颗粒质量标准WS-10894（ZD-0894）-2002中的处方比例，分别称取缺三七的其他药味、缺红大戟的其他药味、缺白及的其他药味，缺百部的其他药味，按照质量标准中规定的制法分别制成缺三七阴性供试品、缺红大戟阴性供试品、缺白及阴性供试品、缺百部阴性供试品，再按照上述方法分别制得4种阴性供试品溶液。

2.3 方法学考察

2.3.1 专属性试验取混合对照品溶液及供试品溶液，在上述色谱条件下进样检测，记录色谱曲线图（图1）。图谱显示白百抗痨颗粒供试品溶液中9种成分与相邻色谱峰分离良好（分离度均≥1.5），供试品溶液的色谱图中，在与对照品溶液色谱图相应保留时间处有相同的色谱峰；理论板数按各成分计均不低于6 500。

图1 混合对照品（A）、白百抗痨颗粒（B）、缺三七阴性样品（C）、缺红大戟参阴性样品（D）、缺白及阴性样品（E）和缺百部阴性样品（F）的HPLC色谱图Figure 1 HPLC chromatograms of mixed reference substances（A），Baibaikanglao granules（B），sample without Notoginseng Radix et Rhizoma（C），sample without Knoxiae Radix（D），sample without Bletillae Rhizoma（E），and sample without Stemonae Radix（F）

2.3.2 线性关系考察取2.2.1项下混合对照品储备液，精密吸取0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、2.5 mL，分别用70%甲醇定容至20 mL，摇匀制得系列线性工作溶液，按“2.1”项色谱条件进样检测，记录色谱曲线图，以三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、3-羟基巴戟醌、芦西定、贝母兰宁、山药素Ⅲ、氧化对叶百部碱、二脱氢对叶百部碱对照品质量浓度为横轴（X，µg/mL），峰面积为纵轴（Y）进行线性回归，结果见表1。

表1 白百抗痨颗粒中各成分的线性关系Table 1 Linear regression relationships of the constituents in Baibaikanglao granules

2.3.3 精密度试验取白百抗痨颗粒（编号：S1）一份供试品溶液，在上述色谱条件下，重复进样6次，记录三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、3-羟基巴戟醌、芦西定、贝母兰宁、山药素Ⅲ、氧化对叶百部碱、二脱氢对叶百部碱色谱曲线及峰面积，得峰面积的RSD值依次为0.56%、1.16%、1.38%、1.65%、1.51%、1.13%、0.69%、1.02%和0.90%，表明精密度良好。

2.3.4 稳定性试验取一份白百抗痨颗粒（编号：S1）供试品溶液，于制备后0、2、4、6、10、16、24 h进样，记录三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、3-羟基巴戟醌、芦西定、贝母兰宁、山药素Ⅲ、氧化对叶百部碱、二脱氢对叶百部碱色谱曲线及峰面积，得峰面积的RSD值依次为0.53%、1.13%、1.43%、1.62%、1.49%、1.16%、0.67%、1.06%和1.02%，表明白百抗痨颗粒供试品溶液24 h内稳定。

2.3.5 重复性试验取一份白百抗痨颗粒（编号：S1）适量，按“2.2.2项”下方法制备白百抗痨颗粒供试品溶液6份，在上述色谱条件下检测分析，记录色谱曲线及峰面积，用外标法计算三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、3-羟基巴戟醌、芦西定、贝母兰宁、山药素Ⅲ、氧化对叶百部碱、二脱氢对叶百部碱的含量，结果各成分的平均含量分别为1.131 、0.310、0.278、0.073、0.044、0.436、0.952、0.531、0.362 mg/g，RSD依次为0.97%、1.49%、1.64%、1.77%、1.89%、1.56%、1.01%、1.29%和1.38%，表明重复性良好。

2.3.6 加样回收率试验取已知各成分含量的白百抗痨颗粒（编号：S1），按照各成分含量精密称取三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、3-羟基巴戟醌、芦西定、贝母兰宁、山药素Ⅲ、氧化对叶百部碱、二脱氢对叶百部碱对照品各适量，用70%甲醇制成质量浓度分别为1.135、0.309、0.271、0.074、0.039、0.434、0.952、0.531、0.354 mg/mL的加样混合对照品溶液。精密称取白百抗痨颗粒1.0 g，共9份，分别精密加入上述加样混合对照品溶液0.8、1.0、1.2 mL各3份，再按“2.2.2”项方法制得加样供试品溶液，在上述色谱条件下检测，得9种成分的平均加样回收率分别为100.03%、98.58%、97.66%、97.05%、96.95%、99.86%、100.15%、99.24%和99.54%，RSD分别为0.72%、1.01%、1.24%、1.52%、1.18%、0.63%、0.80%、0.95%和1.52%。

2.4 含量测定

取白百抗痨颗粒12批（编号：S1～S12），按照“2.2.2”项下方法制备白百抗痨颗粒供试品溶液，再依法进样分析，应用外标法（ESM法）计算白百抗痨颗粒中三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、3-羟基巴戟醌、芦西定、贝母兰宁、山药素Ⅲ、氧化对叶百部碱、二脱氢对叶百部碱的含量（表2），并计算12批次间各成分含量的RSD值。结果显示各待测成分均存在一定的批间差异，表明建立白百抗痨颗粒多指标成分控制模式对稳定其整体质量具有重要意义。

3 白百抗痨颗粒的化学计量学质量评价

3.1 数据归一化处理

对表2中12批白百抗痨颗粒三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、3-羟基巴戟醌、芦西定、贝母兰宁、山药素Ⅲ、氧化对叶百部碱、二脱氢对叶百部碱的含量检测结果进行数据归一化处理（表3）。

表2 含量测定结果Table 2 Results of content determination（n=3） w/（mg·g-1）

3.2 聚类分析（cluster analysis，CA）

将表3中白百抗痨颗粒中三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、3-羟基巴戟醌、芦西定、贝母兰宁、山药素Ⅲ、氧化对叶百部碱、二脱氢对叶百部碱含量归一化后的数据导入SPSS 26.0软件，采用平均联接法，以Euclidean距离为测度，运行系统聚类程序进行CA，得图2。结果显示，当类间距离为10时，12批白百抗痨颗粒聚为3类，S4、S5、S6、S3、S2和S1聚为第Ⅰ类，S8、S9和S7聚为第Ⅱ类，S10、S11和S12聚为第Ⅲ类。

图2 12批样品CA图Figure 2 Dendrogram for CA for 12 batches of samples

表3 各成分归一化处理结果Table 3 Results of normalization treatment for each component

3.3 主成分分析（principal component analysis，PCA）

将表3中含量归一化后数据导入SPSS 26.0统计软件进行降维分析，得各主成分特征值和方差贡献率（表4）及成分矩阵表（表5）。由表4可知前2个主成分特征值为6.529和1.618（均大于1），对方差的贡献率分别为72.547%和17.980%，累计方差贡献率为90.527%（大于85%），表明选取前2个主成分即可代表白百抗痨颗粒90.527%的信息量。表5主成分矩阵可以看出第一主成分的信息来自三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、芦西定、贝母兰宁、山药素Ⅲ和二脱氢对叶百部碱，第二主成分的信息来自3-羟基巴戟醌和氧化对叶百部碱。同时应用多元变量统计软件SIMCA 14.1建立PCA模型得PCA得分图（图3），共提取出2个主成分R2X为0.905，大于0.5，所建立的模型稳定性较高，进一步说明2个主成分可以代表白百抗痨颗粒的整体质量情况。从图3可以看出，S1～S6、S7～S9以及S10～S12分别呈现一定关联性。为进一步分析引起质量差异的主要成分，进行了PLS-DA。

图3 PCA得分图Figure 3 Score plot of PCA

表4 白百抗痨颗粒中主成分方差分析Table 4 Principal component analysis of variance in Baibaikanglao granules

表5 白百抗痨颗粒中9种成分的成分矩阵表Table 5 Composition matrix of 9 ingredients in Baibaikanglao granules

3.4 偏最小二乘法-判别分析（partial least squaresdiscriminant analysis，PLS-DA）

偏最小二乘法-判别分析通过对数据的分析，能够查找出引起产品质量差异的特征成分，将各成分含量数据导入SIMCA 14.1统计软件，运行PLS-DA程序，得图4，结果累积解释能力参数（R2X、R2Y）分别为0.905和0.901（大于0.5），预测能力参数Q2为0.816，所建立的模型稳定可靠、预测能力强，3组样品聚类良好，分离更加显著，与CA、PCA结果一致。

图4 12批白百抗痨颗粒样品的PLS-DA模型得分图Figure 4 Score plot of PLS-DA of 12 batches of BaibaiKanglao granules samples

对建立的PLS-DA模型进行200次置换检验，结果显示R2拟合直线Y轴截距为0.156，小于0.3，表明所建立的PLS-DA模型结果可靠；Q2拟合直线Y轴截距为-0.237（小于0），表明所构建的PLS-DA模型不存在过度拟合，预测能力好，可有效判别分析12批白百抗痨颗粒的质量差异（图5）。结合变量重要性投影（VIP）法筛选影响白百抗痨颗粒化学成分差异的标志性成分（图6），以VIP＞1为标准，筛选到3个成分具有统计学意义，即成分8（氧化对叶百部碱，VIP=1.889）＞成分1（三七皂苷R1，VIP=1.167）＞成分7（山药素Ⅲ，VIP=1.097），可能是影响白百抗痨颗粒产品质量的主要潜在标志物。

图5 PLS-DA置换检测结果图Figure 5 Permutation plot of PLS-DA

图6 12批白百抗痨颗粒样品的VIP图Figure 6 VIP values of samples of 12 batches of BaibaiKanglao granules samples

4 讨论

4.1 流动相的优化筛选

本试验在筛选流动相时，首先采用乙腈-水梯度洗脱，结果基线严重漂移，色谱峰不能正常积分，遂加入酸类加以调节，试验中比较了加入磷酸、冰醋酸以及甲酸的分离效果，最后发现乙腈-0.5%磷酸效果最佳，达到基线分离且峰形较好，三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、3-羟基巴戟醌、芦西定、贝母兰宁、山药素Ⅲ、氧化对叶百部碱、二脱氢对叶百部碱响应值最高，最终采用乙腈-0.5%磷酸作为流动相进行检测。

4.2 供试品溶液制备

本试验在考察供试品溶液制备方式时，首先采用不同浓度的甲醇和乙醇为提取溶剂，对比超声和加热回流提取方式，结果70%甲醇超声提取30 min时，9种成分的提取率最高，杂质干扰最少，方法简单实用，有良好的重现性。

4.3 化学计量学结果评价

化学计量学是集数学、统计学、计算机科学等学科于一身，通过解析实验检测数据，发掘众多变量复杂数据中存在的互相内在关系，无监督统计方法的CA、PCA、非线性映射等及有监督统计方法的PLS、PLS-DA、OPLS-DA等近年来越来越多地应用于中药及其制剂的研究中。CA根据同类样品的相似度大在多维空间中距离较小的原理，对未知样本进行分类。本试验对12批白百抗痨颗粒含量测定的数据归一化后进行CA，结果当间距为10时12批样品聚为3类，说明白百抗痨颗粒具有明显分类趋势，S1～S6聚为一类；S7～S9聚为一类；S10～S12聚为一类。PCA是将具有一定相关性的变量，通过数据降维排除相互重叠的信息，在保存大量信息的同时降低了变量个数，对成分复杂的中药制剂研究具有重要意义。本试验PCA结果显示选取2个主成分即可代表白百抗痨颗粒中9种成分90.527%的信息，具有较好的代表性，同时12批样品的分类与聚类分析结果一致。PLS-DA分析通过模式识别发掘引起产品质量差异的特征成分。本试验在对12批白百抗痨颗粒中9种成分含量检测数据进行PLSDA分析，将PLS-DA模型进行200次置换检验，结果显示所构建的PLS-DA模型未过度拟合，预测能力好，可有效判别分析12批白百抗痨颗粒的质量差异，筛选出3个成分（氧化对叶百部碱、三七皂苷R1和山药素Ⅲ）的VIP值大于1，可能是影响产品质量差异的标志性化学成分，同时提示药企在生产白百抗痨颗粒时，应集中关注这些成分对应的中药材质量，从而提高产品质量和用药的有效性。

本试验采用HPLC多成分定量控制联合多维模式识别法对同一厂家不同批次的白百抗痨颗粒进行了综合质量评价，建立了白百抗痨颗粒9种指标成分定量质控模式，建立的方法稳定可行，简单快捷，不仅有助于为其制定更严谨的质量标准提供实验基础，也对后期该产品质量的提升具有一定的指导意义。