粗茎秦艽根结线虫病的病原鉴定

李云霞, 杨艳梅, 李朝凤, 彭昌田, 胡先奇*

(1. 云南农业大学植物保护学院,省部共建云南生物资源保护与利用国家重点实验室, 昆明 650201;2. 云南省丽江市农业科学研究所, 丽江 674100)

粗茎秦艽GentianacrassicaulisDuthieexBurk.为龙胆科秦艽组植物,是一种重要的中药材,以干燥根入药,味辛、苦,性平,入肝、胆、胃经,具有祛风湿、清湿热、退虚热、抑菌、抗炎镇痛、健胃促消化的功效[1-2]。粗茎秦艽主要分布于云南、贵州、四川、西藏等海拔2 300～3 800 m的高山草甸、山坡草地、灌丛及林缘[3-4]。云南省丽江市为粗茎秦艽的道地产区,是我国最大的粗茎秦艽种植基地,种植面积近1 000 hm2[5]。

根结线虫Meloidogynespp.是一类重要的植物病原物,分布于世界各地、适应能力和繁殖能力强,寄主范围广,超过3 000种,可侵染粮食、油料、纤维、烟草、茶叶、果蔬、花卉、药用植物等[6],据报道人参、三七、西洋参、黄芪、桔梗、麦冬、栀子、灯盏花、罗汉果、地黄等百余种药用植物受根结线虫危害[7-8],目前,根结线虫病是影响药用植物生产的主要因子之一,已经严重影响高价值药用植物栽培的发展。广西永福的罗汉果种植面积在2010年达3 350 hm2,其中80%的地块受根结线虫危害,受害较轻者减产20%～30%,严重者可减产50%以上[9]。根结线虫病的发生不仅降低了药用植物的产量,还影响着药用成分的累积,根结线虫侵染越严重越不利于单株三七主根和须根皂苷的合成和累积[10],陕西商洛40%以上的桔梗成品因根结线虫病失去了商品和药用价值,给该地区的桔梗产业造成了严重的经济损失[11]。

我们在调查过程中发现,种植于云南省丽江市的粗茎秦艽受到根结线虫病严重危害,且发生普遍,由于粗茎秦艽多年连作,其根结线虫病害呈逐年加重趋势,该病害现已成为制约丽江市粗茎秦艽产业发展的主要因素之一。迄今尚未见丽江粗茎秦艽根结线虫病研究的相关报道,为明确粗茎秦艽根结线虫病病原线虫种类,于2020年6月至10月3次到丽江市鲁甸乡调查采样,采用形态学和分子生物学方法鉴定粗茎秦艽根结线虫病病原种类。本研究结果将为制定有针对性的防治措施提供理论依据,对保持丽江粗茎秦艽产业健康发展具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 病害标本采集

2020年6月至10月在云南省丽江市鲁甸乡采集具有明显根结的粗茎秦艽植株,该时段粗茎秦艽处于分蘖期,采集完整植株及根际土,做好标注后带回实验室进行观察、分离与鉴定,共采集6个标本,编号为QJ1～QJ6。

1.2 病株田间症状观察

用自来水将病根冲洗干净,纸巾吸干水分后,在体视显微镜下观察根部症状,并拍照记录。

1.3 根结线虫的分离

2龄幼虫:将病根冲洗干净,在体视镜下挑取单卵块放入装有1 mL蒸馏水的1.5 mL离心管中,28℃恒温培养箱中孵化得到2龄幼虫,一部分2龄幼虫人工接种到空心菜上保种扩繁,另一部分置于65℃水浴锅中2～3 min杀死,用4%的甲醛溶液固定保存[12],用于形态指标测量。

雌成虫:解剖根结,挑取雌成虫,用于形态学鉴定和分子生物学鉴定。

1.4 形态学鉴定

2龄幼虫:在显微镜下进行形态观察、形态指标[13]测量和拍照。

雌成虫:在显微镜下观察雌成虫的形态并拍照、测量其形态指标[13]。

会阴花纹制作与观察:参照谢辉[14]的方法进行,将单条雌成虫放在滴有45%乳酸的有机玻璃板上,用解剖刀切取会阴花纹部分,用细小柔软毛刷将附着在角质层上的组织清理干净,将会阴花纹移入滴有纯甘油的载玻片上,外侧朝上,盖上盖玻片在显微镜下观察会阴花纹形态并拍照。

1.5 分子生物学鉴定

1.5.1DNA提取

根结线虫DNA的提取参照Adam等[15]的方法稍做改进:挑取单条雌成虫放入加有5 μL ddH2O的200 μL PCR管中,用灭菌枪头刺破虫体,加入5 μL细胞裂解液(1 μL 10×PCR Buffer (Mg2+,free)、0.8 μL MgCl2、0.05 μL蛋白酶K、3.15 μL ddH2O),短暂离心,放入液氮中冷冻20 min,加入10 μL石蜡油,短暂离心,置于PCR仪中56℃反应80 min,95℃反应15 min,得到根结线虫DNA提取液。

1.5.2rDNA-ITS区、mtDNA-COⅠ区序列扩增得到的DNA提取液选用引物F195/V5367扩增rDNA-ITS序列,F195:5′-TTTCACTCGCCGTTACTAAGG-3′,V5367:5′-TTGATTACGTCCCTGCCCTTT-3′[16],用引物COX1F/COX1R扩增mtDNA-COⅠ序列,COX1F:5′-GGCTGAGCATAGTAGATGATGTT-3′,COX1R:5′-CTACAACATAATAAG-

TATCATG-3′[17],25 μL PCR反应体系:10×PCR Buffer(Mg2+,PLus) 2.5 μL、dNTPs 2 μL、10 μmoL/L上、下游引物各1 μL、DNA模板2.5 μL、Taq酶0.25 μL、ddH2O 15.75 μL。PCR反应程序:94℃预变性4 min;94℃变性30 s,55℃或54℃退火30 s(F195/V5367退火温度为55℃,COX1F/COX1R退火温度为54℃),72℃延伸1 min,35个循环;72℃再延伸10 min。PCR反应结束后,电泳检测PCR反应产物,取5 μL扩增产物、1 μL 6×DNA Loading buffer混匀后点入1.2%琼脂糖凝胶胶孔,110 V、180 mA条件下电泳30 min,使用凝胶成像系统观察拍照。

回收PCR扩增产物,回收产物连接到pMDTM18-T载体,连接产物转入大肠杆菌DH5α感受态细胞,转化后的细胞液中加入50 μL SOD培养基,37℃,200 r/min振荡培养1 h。取150 μL菌液涂布在LB(氨苄青霉素)固体培养基上,过夜培养,挑取单菌落进行PCR鉴定,将阳性克隆委托擎科生物科技有限公司测序,测序结果在GenBank中BLAST比对分析[12]。

1.5.3SCAR特异性片段扩增

使用北方根结线虫的特异性引物Mh-F/Mh-R扩增,Mh-F:5′-GGCTGAGCATAGTAGATGATGTT-3′,Mh-R:5′-ACCCATTAAAGAGGAGTTTTGC-3′[18]。PCR反应体系同1.5.2。PCR反应程序:94℃预变性4 min;94℃变性30 s,61℃退火30 s,72℃延伸1 min,35个循环;72℃再延伸10 min。PCR反应结束后,取5 μL扩增产物、1 μL 6×DNA Loading buffer混匀后点入1.2%琼脂糖凝胶胶孔,110 V、180 mA条件电泳30 min,使用凝胶成像系统观察拍照。

1.6 系统发育树构建

将测序结果提交至National Center for Biotechnology Information(NCBI)核酸数据库进行BLAST比对。采用MAGA 6.0软件的邻接法(neighbor-joining, NJ)以1 000进行bootstrap校验,构建基于rDNA-ITS和mtDNA-COⅠ的系统发育树,分析病原线虫的亲缘关系[19]。

2 结果与分析

2.1 粗茎秦艽根结线虫病田间症状

被线虫侵染的粗茎秦艽叶片黄化,长势不良,根部膨大,形成根结,侵染严重时,根上形成串珠状根结及大根结,主根也出现根结,根结处有白色卵块溢出,部分卵块在溢出根表皮前有浅红色胶状物包裹(图1)。

2.2 病原线虫形态学特征

2龄幼虫头冠狭小,头区无环纹,透明尾有明显界限,尾端通常无纹,少数尾端有缢缩,尾尖阔圆或尖(图2a～c),形态测量数据见表1。雌成虫虫体梨形,颈短,颈部与体分界不明显,口针纤细,口针基部球球形或扁球形,中食道球卵圆形或圆形,中食道球瓣卵圆形(图2d、e),形态测量数据见表1。雌成虫会阴花纹整体呈卵圆形,背弓中等高或低平,线纹平滑至波浪形,侧线不明显,背线与腹线相遇呈一定角度,从而露出侧线的痕迹,有时线纹向一侧或两侧形成翼,尾区有刻点(图2f),故将其初步鉴定为北方根结线虫Meloidogynehapla。

图2 粗茎秦艽根结线虫病病原形态特征Fig.2 Morphological characteristics of pathogenic nematode of Gentiana crassicaulis

2.3 分子生物学鉴定

使用通用引物V5367/F195对粗茎秦艽病原线虫rDNA-ITS区进行PCR扩增,6份标本中分离到的根结线虫均能扩增出约770 bp的目的条带,使用通用引物COX1R/COX1F扩增粗茎秦艽病原线虫mtDNA-COⅠ区,6份标本中分离到的根结线虫均能扩增出大小约410 bp的目的条带(图3)。使用北方根结线虫的特异引物Mh-F/Mh-R扩增6份标本中分离到的根结线虫均能扩增出约为1 500 bp的特异性片段(图4),综上,将危害粗茎秦艽的根结线虫鉴定为北方根结线虫。

图3 6份粗茎秦艽样本中根结线虫rDNA-ITS序列、mtDNA-COⅠ序列扩增片段电泳结果Fig.3 Electrophoresis results of PCR product of rDNA-ITS and mtDNA-COⅠ sequences from root-knot nematode on six samples of Gentiana crassicaulis

2.4 病原线虫PCR产物序列分析及系统发育树构建

6份标本中分离到的根结线虫rDNA-ITS序列在BLAST中比对,结果均与北方根结线虫(登录号为MT249016.1、KJ572385.1、MT951634.1)相似,相似性为100%,mtDNA-COⅠ区序列在BLAST中比对,结果均与北方根结线虫(登录号为MT251177.1、JX683718.1、AY268113.1、MH128567.1、MH399801.1、JX683718.1)相似,相似性为100%。

6份标本上分离到的根结线虫rDNA-ITS序列以100%的支持率与GenBank中已登录的北方根结线虫(登录号为MT249016.1、KJ572385.1、MT951634.1)聚为一支,mtDNA-COⅠ区序列以99%的支持率与GenBank中已登录的北方根结线虫(登录号为MT251177.1、JX683718.1、AY268113.1、MH128567.1、MH399801.1、JX683718.1)聚为一支,故将其鉴定为北方根结线虫(图5)。

3 结论与讨论

本研究通过形态学和分子生物学方法将粗茎秦艽根结线虫病的病原鉴定为北方根结线虫,属国内在粗茎秦艽上的首次报道,研究结果为制定粗茎秦艽根结线虫病的防治方案提供了理论依据。北方根结线虫是世界上最常见的4种根结线虫之一[21],通常分布于北方冷凉地区。在云南,北方根结线虫主要分布在海拔 1 700 m以上的地区,根据现有报道,昆明、蒙自、大理等地均发现有北方根结线虫的分布[22-23]。多数药用植物种植在高海拔地区,气候冷凉,这些区域恰巧适合北方根结线虫生存。前人调查研究发现附子、三七、人参、白术、甘草、决明、党参等药用植物都受到北方根结线虫危害[24-26];在河北省安国县有62种药用植物被北方根结线虫危害[27];据统计我国14个省、市、自治区有100余种药用植物受到根结线虫的危害,其中70余种药用植物受到北方根结线虫危害[7]。丽江市鲁甸乡海拔在2 100 m以上,年平均气温11℃,霜期180 d左右,年平均气温较低,该地区地理环境适宜北方根结线虫生存,在调查研究中也仅发现北方根结线虫危害,这和前人的研究报道是一致的。

是否存在其他种类根结线虫为害粗茎秦艽,是一个值得探索的问题。本研究所采集的标本仅局限于丽江市鲁甸乡粗茎秦艽种植区,要评估该病的发生范围,还需扩大样本采集区域,进一步开展相应工作。

根结线虫病的发生为害将严重影响粗茎秦艽的生产,应加强粗茎秦艽根结线虫病的防控。鉴于粗茎秦艽为药用植物,采用绿色综合防治策略是粗茎秦艽产业可持续发展和环境保护的有效途径。建议在粗茎秦艽种植过程中注重育苗地的选择及管理,防止种苗携带根结线虫病;与菊科、禾本科等根结线虫非寄主植物轮作,可明显降低土壤中根结线虫虫口数量[28];施用淡紫拟青霉Paecilomyceslilacinus等微生物菌剂可通过改变根系微生态,促进植株生长,抑制根结线虫的侵染,同时这些微生物还能寄生在根结线虫卵和幼虫体内使其死亡[29];施用生物活性有机肥可改良土壤,增加植株株高、茎粗和地上部分生物量,并对根结线虫病有良好抑制效果[30]。药用植物的特殊性决定了粗茎秦艽的质量尤为重要,为使粗茎秦艽达到高效、安全、绿色无污染的标准,在粗茎秦艽根结线虫病防治方面,科学地将农业防治、物理防治、化学防治和生物学防治等方法相结合,以达到专一性强、操作简单并且对人畜环境无害等要求。