一例猪轮状病毒感染引起仔猪腹泻的实验室诊断与防制

葛生虎，高明艳

（1.河北铭诸生物科技有限公司，河北 邢台 054000；2.青海农牧科技职业学院，青海 西宁 812100）

猪轮状病毒（Porcine Rotavirus, PoRV）属于呼肠病毒科、轮状病毒属重要成员，是导致仔猪腹泻的重要传染性病原之一[1]。猪轮状病毒在我国不同地区广泛分布，但多以散发或局部暴发为特征，且主要发生于冬季和春季等寒冷季节[2]。不同发育阶段猪群对PoRV均易感，但仔猪感染该病原后出现的临床症状最明显且严重，主要为水样腹泻、脱水和呕吐等，且病死率较高；成年猪群（母猪、肥育猪等）感染该病不表现明显临床症状，但处于隐性感染阶段，且可对外排毒，也会对其它健康猪群造成威胁[3]。

可导致仔猪腹泻的病原种类繁多，其中最常见的肠道腹泻相关病毒包括猪流行性腹泻病毒（Porcine Epidemic Diarrhea Virus, PEDV）、猪传染性胃肠炎病毒（Porcine Transmissible Gastroenteritis Virus, TGEV）、猪轮状病毒（PoRV）和猪德塔冠状病毒（Porcine Deltacoronavirus, PDCoV）等。自2010年以来，PEDV变异株广泛流行，给我国养猪业造成了巨大的经济损失，且目前猪流行性腹泻（Porcine Epidemic Diarrhea, PED）仍然是导致仔猪腹泻的主要肠道病毒性疾病[4]。这使得大部分养殖人员当仔猪发生腹泻时首先想到的便是PED，而忽略了PoRV、PDCoV感染等“少见”疾病的存在，继而可能因误诊而延误疾病最佳防控期。

2022年4月初，河北石家庄某养殖合作社猪场仔猪出现腹泻疫情，为确诊病因，该场迅速将腹泻仔猪送至河北铭诸生物科技有限公司进行实验室诊断。在排除了该场仔猪发病不是PEDV、猪圆环病毒、猪伪狂犬病病毒（PRV）、猪瘟病毒（CSFV）等感染引起的情况下，我们检测了其它“少见”病原，最终确定为PoRV感染；进一步扩增与分析该毒株的VP7基因序列，确定该毒株为基因9型（G9）。确定病因后采取一系列防控措施，最终使疫情得到有效控制。

1 发病猪场

河北省石家庄平山县某养殖专业合作社饲养能繁母猪300余头，2022年4月初该猪场产房个别栏舍仔猪出现腹泻。其主要临床症状为：发病仔猪初期采食量下降、精神萎靡且轻微呕吐等；后期严重腹泻，且粪便为黄色或黑色带血丝，严重脱水等。截至4月10日，该场有200余头初生仔猪腹泻，尽管采取了对症治疗，但病死率仍然近80%。

咨询该场的负责人得知，该场之前发生过一次类似的腹泻疫情，但对猪群免疫接种腹泻三联灭活疫苗（PEDV+TGEV+PoRV）后控制了疫情。当前该场已对猪群免疫接种了常规疫苗，其中包括针对猪伪狂犬病、猪口蹄疫、猪瘟、蓝耳病、圆环病毒病、细小病毒病和乙脑等多种疫苗，但却忽视了接种针对肠道腹泻病毒病的相关疫苗。

2 临床症状及病理变化

观察腹泻仔猪整体状况，发现仔猪极度消瘦（图1A），且仔猪因持续腹泻臀部肌肉松弛，粘满黄色粪便（图1B），地面多处可见黄白色粪污或呕吐物（图1C和图1D）。剖检发现病变主要出现于小肠，可见肠壁胀气且薄，肠系膜淋巴结肿大充血等，胃内有大量未消化的乳凝块。

3 实验室诊断结果

为确定发病原因，采集4头严重腹泻仔猪小肠组织样品送至河北铭诸生物科技有限公司，分别进行细菌分离鉴定和常见病毒性病原诊断。

3.1 细菌分离鉴定结果

在超净工作台下，使用灭菌眼科剪剪开肠道深层组织，用火焰灼烧并冷却的接种环蘸取少量组织液分别在鲜血固体营养琼脂培养基和普通固体营养琼脂培养基表面平板划线。其后将培养基置于37 ℃恒温箱内培养16～24 h，观察培养基表面是否出现疑似菌落。结果发现4份样品在2种培养基表面均未出现疑似菌落，提示该猪场发病并非细菌病感染引起。

3.2 病毒性病原诊断结果

用灭菌手术刀和手术剪切取少量肠组织放入2.0 mL离心管内，加入少量生理盐水和钢珠，低温高速匀浆并反复冻融3次，低温离心后取上清液保存于-80 ℃，待检。取200 µL上清液使用商业化DNA/RNA基因组提取试剂盒进行核酸（DNA和RNA混合物）提取，并使用cDNA反转录试剂盒将核酸中RNA反转录为cDNA。应病料送检员要求，使用商业化试剂盒以real-time PCR法分别检测4份样品中是否存在PEDV、PRV、PCV2（圆环病毒2型）、PRRSV（蓝耳病病毒）、CSFV和PDCoV核酸，结果以上病原均为阴性。随后在笔者建议下，我们再次检测TGEV（传染性胃肠炎病毒）和PoRV核酸，结果发现4份样品TGEV核酸均为阴性，但PoRV核酸均为阳性，且CT值为22～25。根据临床及实验室诊断结果，我们判定该场仔猪腹泻是PoRV感染引起的。

3.3 PoRV毒株VP7基因序列RT-PCR扩增、测序与分析

为确定该场流行PoRV毒株基因型及遗传变异情况，根据参考文献[4]合成扩增PoRV毒株VP7基因序列特异性引物，引物序列为：VP7-F：5'-GGCTTTAAATGAGAGAATTTCCGTCTGG-3'；VP7-R：5'-GGTCACATCATACAATTCTAATCTAA G-3'，扩增产物大小为1 062 bp，引物由北京擎科生物科技有限公司合成。以RT-PCR法体外扩增1份CT较低核酸样品VP7基因序列，其扩增体系（50 μL）包括2×PCR预混液25.0 μL，上、下游引物（10 μmol/L）各2.0 μL，cDNA模板3.0 μL及双蒸水18.0 μL；RT-PCR扩增条件为95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，共35个循环；最后以72 ℃延伸7 min。反应结束后取RT-PCR产物进行凝胶电泳，其结果如图2所示，扩增得到的PoRV毒株VP7基因序列产物大小约1 000 bp，与已知阳性对照扩增产物大小一致，提示我们成功扩增得到PoRV VP7基因序列。其后将该产物送至北京擎科生物科技有限公司进行双向测序。

测序结果拼接后去除前后不准确序列，将最终序列在NCBI上进行BLAST比对，发现该毒株序列与GenBank数据库收录的PoRV G9型中国株（JF781163.1）VP7核苷酸序列同源性最高，为99.8%，与其它PoRV G9型毒株VP7基因序列同源性均高于95%；但与其它基因型PoRV毒株同源性较低，由此推测该猪场暴发的PoRV毒株属于G9型。

4 防控措施制定与实施

确定该场仔猪发生腹泻是由PoRV G9型感染引起后，我们采取系列措施用于防控该病：1）将发病仔猪与假定健康猪群隔离饲养，同时将无治疗意义的腹泻仔猪扑杀，并无害化处理；给予发病较轻仔猪进行对症治疗，如提供富含电解质饮水防止仔猪脱水；提高产房温度减少仔猪体温损失；给仔猪灌喂抗生素防止继发细菌病感染等；2）对该场猪群紧急免疫接种腹泻病毒三联弱毒疫苗，仔猪出生后保证足量且优质的初乳，减少母猪应激等；3）对猪舍内外环境反复消毒；在猪舍过道铺撒生石灰等保持猪舍干燥；实行“全进全出”管理体制等。

实施以上防制措施后，当时腹泻仔猪死亡率仍然较高，但较未采取措施之前低；其后初生仔猪的死亡率极大降低，且猪场生产成绩逐渐恢复正常。

5 讨论

可导致仔猪腹泻的病原种类繁多，但大部分养殖户认为当前引起仔猪腹泻的肠道病毒主要是PEDV和PDCoV等[5]，而忽略了TGEV、PoRV等“不常见”病原。就目前而言，针对PED的弱毒或灭活疫苗已广泛应用于我国猪场，这使得PEDV在猪场流行情况有所缓解，也导致其它肠道病毒导致仔猪腹泻比例逐渐提高。王成等调查结果表明，2021年春季湘西地区仔猪腹泻样品PoRV检出率达25.08%（76/303），且未检出PEDV、TGEV和PDCoV等常见肠道病毒，这说明PoRV是导致该地区仔猪腹泻的主要肠道病毒[3]。若猪场发生仔猪腹泻，养殖场应尽可能检测多种病原，防止漏检、延误疾病最佳治疗期。

为进一步确定该场PoRV流行株基因型特征，我们扩增并分析该毒株的VP7基因序列特征，发现该毒株VP7基因序列与PoRV G9型中国株（JF781163.1）VP7核苷酸序列同源性最高，提示该毒株可能为G9型，以上试验结果为该病的防控提供了科学依据。

由于目前暂无针对猪轮状病毒病的特效药物，因此对该病的防治应以对症治疗和疫苗接种为主。尽管我们采取了系列措施对腹泻仔猪进行治疗，但仍然有部分腹泻仔猪死亡，说明仔猪感染该病后一般治疗效果较差。但对产前母猪免疫接种疫苗后，初生仔猪摄取足够的母源抗体后对该病的防控效果较好。值得注意的是，成年猪群对PoRV也十分敏感，虽然感染该病后不表现明显临床症状，但仍然可对外排毒，继而威胁其它健康猪群[3]。因此对于PoRV的防控应尽量对所有猪群免疫接种疫苗，同时提高饲养管理水平等。