右美托咪定对老年小鼠剖腹探查术所致神经炎症的影响

王飞 吴毅 沈智文

手术产生的创伤，或者围手术期的刺激，比如大脑缺血缺氧、血压剧烈波动、麻醉，都会对患者的认知功能产生影响，从而造成术后认知功能障碍（Post-operative cognitive dysfunction，POCD）。尤其部分有基础疾病或者高龄的患者，本身认知功能较差，加上手术、围手术期应激反应，以及麻醉药的使用，都会对患者认知功能产生影响。POCD的发生不仅影响生活质量和增加医疗负担，而且导致死亡率增加。而神经炎症是在POCD 的病理生理机制中发挥着关键性作用。已有研究表明老年小鼠在经历剖腹探查术后发生神经炎症与学习记忆功能的损伤［1］。作为一种高选择性α2肾上腺素能受体激动剂，右美托咪定通过激活α2肾上腺素受体产生镇静作用［2］。另外，右美托咪定可抑制海马神经元凋亡，从而减缓认知功能障碍的进程［3］，并且右美托咪定可通过抑制星型胶质细胞焦亡发挥神经保护作用［4］，以上研究提示右美托咪定可能在认知功能障碍中具有神经保护作用。而这种神经保护作用是否与其抑制海马区炎症有关，目前尚不清楚。本研究拟建立老年小鼠认知功能障碍模型，研究右美托咪定是否改善老年小鼠剖腹探查术所致神经炎症，为其临床应用提供科学依据。

1 对象与方法

1.1 实验动物SPF 级雄性C57BL/6 小鼠（27-34 g，16 月龄）购自广东省动物实验中心。动物饲养环境为：室温（22±1℃），昼夜节律（12h/12h），湿度（50±10%）。在实验过程中，实验动物的使用遵循实验动物3R 原则。

1.2 主要试剂与仪器右美托咪定（扬子江药业集团有限公司）；OlympusIX70 倒置显微镜（日本奥林巴斯公司）；荧光定量PCR 试剂盒（日本TaKara公司）；IL-1β 抗体（美国Cell Signaling Technology公司）、IL-6 抗体（美国Cell Signaling Technology 公司）、TNF-α 抗体（美国Cell Signaling Technology 公司）、GAPDH 抗体（美国Cell Signaling Technology 公司）、ELISA 试剂盒（美国R＆D Systems 公司）。

1.3 实验分组与干预措施根据随机数字表，将48 只老年C57BL/6 小鼠（16 月龄）随机分成假手术组、手术组、右美托咪定组、右美托咪定+手术组，每组12 只。右美托咪定组腹腔注射25 μg/kg 右美托咪定；手术组行剖腹探查术；美托咪定+手术组在行剖腹探查术前20 分钟预先腹腔注射25 μg/kg右美托咪定。假手术组腹腔注射等体积0.9%生理盐水。剖腹探查术后8 小时，使用ELISA 试剂盒检测各组小鼠海马组织白细胞介素1β（IL-1β）、白细胞介素6（IL-6）、肿瘤坏死因子α（TNF-α）水平；Western blot 检测各组小鼠海马组织IL-1β、IL-6、TNF-α 表达情况。

1.4 动物手术模型建立首先我们使用1.5%异氟醚复合2 L/min 氧气对老年小鼠进行诱导麻醉。待小鼠翻正反射消失确认麻醉起效后实施剖腹探查术，先对小鼠腹部消毒，在腹部上腹正中部作1 至2 cm 的纵切口。随后，逐层解剖进入腹腔后行剖腹探查术，对小鼠的脾、肝脏、胃和肠道等脏器依次探查。整个手术过程在异氟醚麻醉下进行，持续时间大约30 分钟。

1.5 Westernblot 取海马组织置于4℃冰上，然后加入适量RIPA 蛋白裂解液，充分搅拌反应，使用离心机15 000 r/min 离心15 min 后取上清液，利用BCA 法进行蛋白浓度测定。在60V，40mA 条件下电泳2 h，使用恒流250mA 将蛋白转移至PVDF膜，之后用5%BSA 封闭60 min，随后加入一抗抗体，4℃摇床下孵育过夜，然后加入二抗后室温孵育60 min。最后使用ImageJ 软件进行分析处理。

1.6 ELISA取海马组织，按25 mL/g 加入0.9%生理盐水，充分研磨，4℃离心取上清液，按照ELISA试剂盒说明书步骤进行操作，以酶标仪测量波长450 nm 处吸光度值，对应标准曲线，计算对海马炎症因子（IL-1β、IL-6、TNF-α）表达情况。

1.7 统计学分析所有实验数据均采用SPSS22.0软件进行统计学分析，采用单因素方差分析检验对服从正态分布的计量资料进行分析，对于组间的差异采用Turkey 法进行两两比较。实验数据以均数±标准误（mean±SD）表示。检验水准为α=0.05，P＜0.05 为差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1 右美托咪定减轻手术创伤导致的海马神经炎症见图1。

图1 右美托咪定对手术创伤诱发的促炎细胞因子表达升高的影响 A.统计学分析分析假手术组、手术组、右美托咪定组、右美托咪定+手术组海马组织促炎细胞因子IL-1β 表达情况。B.统计学分析分析假手术组、手术组、右美托咪定组、右美托咪定+手术组海马组织促炎细胞因子IL-6 表达情况。C.统计学分析分析假手术组、手术组、右美托咪定组、右美托咪定+手术组海马组织促炎细胞因子TNF-α 表达情况。与假手术组相比，*P＜0.05, 与手术组相比，#P＜0.05

2.2 右美托咪定对手术创伤导致的海马促炎因子IL-1β 表达水平的影响见图2。

图2 右美托咪定对手术创伤导致的海马IL-1β 表达水平的影响 A. Western blot 分析假手术组、手术组、右美托咪定组、右美托咪定+手术组海马组织IL-1β 蛋白表达情况。B. 统计学分析分析各组IL-1β 与GAPDH 的比值。与假手术组相比，*P＜0.05，与手术组相比，#P＜0.05

2.3 右美托咪定对手术创伤导致的海马促炎因子IL-6 表达水平的影响见图3。

图3 右美托咪定对手术创伤导致的海马IL-6 表达水平的影响 A.Western blot 分析假手术组、手术组、右美托咪定组、右美托咪定+手术组海马组织IL-6 蛋白表达情况。B.统计学分析分析各组IL-6 与GAPDH 的比值。与假手术组相比，*P＜0.05, 与手术组相比，#P＜0.05

2.4 右美托咪定对手术创伤导致的海马促炎因子TNF-α 表达水平的影响见图4。

图4 右美托咪定对手术创伤导致的海TNF-α 表达水平的影响 A.Western blot 分析假手术组、手术组、右美托咪定组、右美托咪定+手术组海马组织TNF-α 蛋白表达情况。B.统计学分析分析各组TNF-α 与GAPDH 的比值。与假手术组相比，*P＜0.05，与手术组相比，#P＜0.05

Western blot 结果表明，与假手术组比较，手术组海马组织中促炎因子TNF-α 蛋白表达水平明显升高（P＜0.05），而与手术组相比，右美托咪定+手术组促炎因子TNF-α 蛋白表达水平明显降低（P＜0.05），表明右美托咪定能够逆转手术创伤导致的海马促炎因子TNF-α 表达升高。

3 讨 论

前期有研究证明，手术创伤可导致神经炎症，从而进一步诱发认知功能障碍［5］。本研究通过建立老年小鼠术后认知功能障碍模型，证明右美托咪定能减轻手术创伤诱发的神经炎症，逆转手术创伤诱发的促炎因子IL-1β、IL-6、TNF-α 的表达增加。

右美托咪定常在临床上用于患者的镇静，其神经保护作用已被多次证实［6］。近年来，已被证实右美托咪定对神经认知功能具有保护作用［7］。除了镇静作用外，右美托咪定还可能具有抗炎作用，而这被认为是其认知保护作用的潜在机制［8］。另一项研究的结果表明，外周应用右美托咪定可抑制脂多糖诱导的神经炎症［9］。有研究通过全身使用α2 肾上腺素受体拮抗剂来证明α2 肾上腺素受体在右美托咪定发挥神经保护中的作用［4］。右美托咪定可以降低血液中促炎细胞因子的水平，而促炎细胞因子是破坏血脑屏障完整性和诱导神经炎症的关键因素［10］。在阿尔兹海默症动物模型中，右美托咪定可以通过抑制氧化应激和炎症反应保护神经元免受变性［11］。而与以前的研究相一致，本研究结果提示右美托咪定能减轻手术创伤诱发的海马神经炎症，逆转剖腹探查术引起的促炎细胞因子表达升高。

本研究通过建立剖腹探查术诱导老年小鼠海马组织神经炎症模型，发现手术前使用右美托咪定预处理能通过减轻手术创伤诱发的促炎因子IL-1β、IL-6、TNF-α 的表达增加，为右美托咪定用于防治术后认知功能障碍提供科学依据。