明暗箱实验：昆明小鼠状态焦虑动物模型实验条件筛选

王 群，马 飞，王学斌，马月香，孙世光

(山东中医药大学 1.中医学院、2.附属医院、3.第二附属医院，山东 济南 250001；4.济南市市中区人民医院眩晕科，山东 济南 250002；5.山东省中医院，山东 济南 250014；6.山东省中西医结合医院，山东 济南 250001)

焦虑症是最常见的精神障碍，临床常与其他类精神障碍合并共存；2019年全球疾病负担研究发现，焦虑症是导致10～24岁青少年伤残调整生命年的第六位主要疾病[1-2]。明暗箱实验(light/dark box，LDB)是状态焦虑动物模型行为学评价的经典方法，广泛用于焦虑症发病机制与药物筛选研究；啮齿类实验动物LDB焦虑情绪主要是基于明暗光线刺激冲突产成，其行为模式受实验装置(形状、材质、尺寸等)、实验动物(品系、年龄、性别等)及实验操作(起始位置、记录时间、重测测量及周期节律等)诸多因素影响[3-4]。因此，本研究依据LDB作为状态焦虑动物模型的评价方法与原理，初步探讨昼夜节律、光照面积、光照颜色以及光照强度等因素对昆明小鼠LDB行为模式的影响，以期筛选出LDB作为状态焦虑动物模型评价方法的稳定实验条件。

1 材料与方法

1.1 实验动物昆明小鼠，雄性(♂)，由山东大学实验动物中心提供，许可证号：SYXK(鲁)20130001；室温(20±2)℃，黑暗12 h(6 ∶00～18 ∶00)和光照12 h(18 ∶00～6 ∶00)环境，自由进水饮食饲养；预适应环境1周后，选取体质量(20±2)g小鼠进入正式实验。

1.2 实验装置明暗箱(45 cm × 27 cm × 27 cm)，木质，包括3部分：大面积箱体(27 cm × 27 cm × 27 cm)，底部分成9个面积相等的方格(9 cm × 9 cm)；小面积箱体(18 cm × 27 cm × 27 cm)，底部分成6个面积相等的方格(9 cm × 9 cm)；两箱体隔板(可移动)之中央通道(7 cm × 7 cm)。明箱区采用30 W白灯泡离箱底40 cm高处照明；暗箱区采用30 W红灯泡(或其他实验彩色)离箱底40 cm高处照明。

1.3 实验操作操作者将昆明小鼠置于大面积箱体正中央格，用摄像系统记录动物5 min的行为变化，包括两箱停留时间、水平运动、垂直运动、穿梭次数以及粪便粒数；其中，四只爪子均进入一格方可记录水平运动1次，两前爪腾空或攀附墙壁方可记录垂直运动1次。纳入实验参数：明区停留时间百分率(Ltime%)、明区水平运动百分率(Lcross%)、明区垂直运动百分率(Lrear%)、水平运动总得分(Cross)、垂直运动总得分(Rear)、总得分(Total=Cross+Rear)、穿梭次数(Transition)和两区粪便粒数(Lfbs，Dfbs)及粪便总粒数(Fbs=Lfbs+Dfbs)。

1.4 实验条件LDB实验条件影响因素主要考察昼夜节律(白天黑夜)、光照面积(明箱区)、光照颜色(暗箱区)、光照强度(明箱区)以及昼夜节律与光照面积交互效应。其中，昼夜节律主要考察白天周期(18 ∶00～6 ∶00；Day)、黑夜周期(6 ∶00～18 ∶00；Night)对实验动物LDB行为模式影响；光照面积主要考察眀箱区光照大面积箱体(L3/5)、小面积箱体(L2/5)对实验动物LDB行为模式影响；昼夜节律与光照面积采用析因设计分组：Day-L3/5(n=6)，Day-L2/5(n=6)，Night-L3/5(n=6)，Night-L2/5(n=6)。光照颜色主要考察暗箱区光照颜色黄色(Yellow，n=6)、绿色(Green，n=6)、蓝色(Blue，n=6)、红色(Red，n=6)对实验动物LDB行为模式影响，明箱区采用30 W白灯泡光照；实验周期选取Night。光照强度主要考察眀箱区光照强度15 W(n=6)、25 W(n=6)、40 W(n=6)、60 W(n=6)、100 W(n=6)对实验动物LDB行为模式影响，暗箱区采用30 W红灯泡光照；实验周期选取Night。

1.5 统计学分析采用SPSS 13.0 for Windows软件进行统计分析，GraphPad Prism 5.0软件进行统计作图。Kolmogorov-Smirnov检验由Analyze→Nonparametric Tests→One-Sample Kolmogorov-Smirnov Test程序完成；Levene检验由Analyze→Compare Means→One-Way ANOVA(Homogeneity of Variances Test)程序完成。t检验由Analyze→Compare Means→One-SampleTTest/Independent-SamplesTTest程序完成；单因素ANVOA由Analyze→Compare Means→One-Way ANOVA程序完成；析因设计ANVOA由Analyze→General Linear Model→Univariate程序完成；Kruskal-Wallis检验Analyze→Nonparametric Tests→K-Independent-Samples Tests。所有数据先进行Kolmogorov-Smirnov正态分布检验和Levene方差齐性检验；依据正态分布结果进行t检验/单因素ANOVA/析因设计ANOVA/Kruskal-Wallis检验，P<0.05表示差异有统计学意义[5-6]。

2 结果

2.1 昼夜节律Kolmogorov-Smirnov检验提示，LDB实验参数Ltime%、Lcross%、Lrear%、Cross、Rear、Total、Transition、Fbs所有数据均符合正态分布(P>0.05)；Levene检验提示，LDB实验参数Ltime%、Lcross%、Cross、Rear、Total数据均符合方差齐性(P>0.05)。t检验结果提示，与黑夜周期相比，白天周期LDB实验参数Ltime%、Lcross%、Lrear%、Cross、Rear、Total、Transition、Fbs差异变化均无统计学意义(P>0.05)，见Fig 1。

2.2 光照面积Kolmogorov-Smirnov检验提示，LDB实验参数Ltime%、Lcross%、Lrear%、Cross、Rear、Total、Transition、Fbs所有数据均符合正态分布(P>0.05)；Levene检验提示，LDB实验参数Ltime%、Lcross%、Lrear%、Rear、Total、Transition、Fbs数据均符合方差齐性(P>0.05)。t检验结果提示，与3/5相比，光照大面积箱体(L3/5)LDB实验参数Lcross%(Day：t=5.363，P<0.01)升高，且差异具有统计学意义；与2/5相比，光照小面积箱体(L2/5)LDB实验参数Lrear%(Day：t=3.211，P<0.05)升高，且差异具有统计学意义。进一步析因设计ANOVA结果提示，昼夜节律对LDB实验参数影响差异均无统计学意义(P>0.05)，而光照面积对LDB实验参数Ltime%(F(1，20)=18.361，P<0.01)、Lcross%(F(1，20)=49.148，P<0.01)、Lrear%(F(1，20)=8.424，P<0.01)影响差异具有统计学意义；昼夜节律与光照面积对LDB实验参数存在交互作用影响，但差异无统计学意义(P>0.05)，见Fig 1。

2.3 光照颜色Kolmogorov-Smirnov检验提示，LDB实验参数Ltime%、Lcross%、Lrear%、Cross、Rear、Total、Transition、Fbs(而非Dfbs、Lfbs)数据均符合正态分布(P>0.05)；Levene检验提示，LDB实验参数Ltime%、Lcross%、Lrear%、Rear、Transition、Fbs数据均符合方差齐性(P>0.05)。单因素ANOVA结果提示，光照颜色对LDB实验参数Rear(F(3，20)=3.746，P<0.05)、Fbs(F(3，20)=3.585，P<0.05)影响效应差异具有统计学意义；Dunnettt检验结果提示，与Red组相比，Yellow组LDB实验参数Rear(MD=-30.833，P<0.05)显著降低，且差异具有统计学意义；Kruskal-Wallis检验结果提示，光照颜色对Lfbs、Dfbs影响效应差异无统计学意义(P>0.05)，见Fig 2。

2.4 光照强度Kolmogorov-Smirnov检验提示，LDB实验参数Ltime%、Lcross%、Lrear%、Cross、Rear、Total、Transition、Fbs(而非Dfbs、Lfbs)所有数据均符合正态分布(P>0.05)；Levene检验提示，LDB实验参数Ltime%、Lcross%、Lrear%、Cross、Rear、Total、Transition、Fbs数据均符合方差齐性(P>0.05)。单因素ANOVA结果提示，光照强度对LDB实验参数Cross(F(4，25)=2.569，P<0.05)、Total(F(4，25)=2.588，P<0.05)影响效应差异具有统计学意义；Dunnettt检验结果提示，与15 W组相比，100 W组LDB实验参数Cross(MD=-173.167，P<0.05)、Total(MD=-93.667，P<0.05)明显降低，且差异具有统计学意义；Kruskal-Wallis检验结果提示，光照强度对Lfbs、Dfbs影响效应差异无统计学意义(P>0.05)，见Fig 3。

Fig 1 Effect of day-night rhythm and illumination area on behavioral pattern of light/dark box(n=24)Solid bars，dark cycle;Hollow bars，light cycle;Wide bars，light at L3/5 area;Narrow bars，light at L2/5 area.*P<0.05，#P<0.01 vs Wide bars.

Fig 2 Effect of illumination color (in Dark box) on behavioral pattern of light/dark box♂ n=24.*P<0.05 vs Red light.

Fig 3 Effect of illumination intensity (in Light box) on behavioral pattern of light/dark box(n=30)*P<0.05 vs 15 W.

3 讨论

外界环境(光线、噪音、清洁度等动物福利)可以明显影响实验动物行为与生理变化，并导致实验数据波动变异[7-8]。已有研究证实[9-10]，啮齿类实验动物视觉系统对紫外光区与中波长可见光区(绿光)敏感，而对红光及红外光区不敏感，这可能与啮齿类实验动物视觉系统是二元色，视网膜缺乏识别红光锥体细胞相关；然而，最新研究发现[11-13]，啮齿类实验动物行为与生理受光线影响(包括红光)，这可能与啮齿类实验动物行为与生理受视觉、触觉、听觉以及交感神经系统等不同神经通路交互式传递、不同脑区分布式编码控制有关。

本研究结果提示，光照面积可明显影响LDB焦虑行为模式(Ltime%、Lcross%、Lrear%)，且光照面积通过昼夜节律影响LDB焦虑行为模式，尤其是与明箱区空间面积相比，白天周期LDB焦虑行为(Lcross%、Lrear%)明显增加；光照颜色(黄光)可明显影响LDB探索行为模式(Rear)，光照强度(100 W)可明显影响LDB运动行为模式(Cross、Total)。同时，啮齿类动物情绪行为的形成与表达与先天遗传与后天环境密切相关[18]，而状态焦虑评价受外界环境及操作条件等后天因素的影响更为明显，应注意到本研究可能存在的缺陷：①昼夜颠倒预适应环境周期仅1 w；②光照颜色是通过灯罩颜色过滤获取；③光照强度采用灯泡功率大小区分；上述因素亦可能导致LDB行为模式一定程度的偏移。