钩吻不同部位11种生物碱含量的检测分析

陈超杰 叶美麟 覃妮凤康宸毓 江 政 黄 蘅 罗达龙*

（1梧州学院食品与制药工程学院，广西梧州 543002；2梧州市食品药品检验所，广西梧州 543002）

钩吻（Gelsemium elegans Benth.）是马钱科胡蔓藤属多年生常绿藤本植物，广泛分布在我国的南部至西南地区，又称为断肠草、胡蔓草、大茶药、野葛、过山风等。钩吻虽然是一种剧毒植物，但在民间常通过外用方式治疗疥癞、湿疹、跌打损伤及风湿等病痛，且使用历史悠久[1]。生物碱是钩吻主要活性成分，同时也是主要毒性物质[2]。现代药理学研究发现，钩吻生物碱具有镇痛、抗肿瘤、抗风湿和抗焦虑等药理作用[3]。本文分析钩吻不同部位的生物碱分布，以期为钩吻的开发利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 试验材料。供试植物为钩吻植株，包含根、茎、叶和花，采购自广西壮族自治区梧州市，采收日期为2019年11月。

1.1.2 试剂。供试试剂有：钩吻生物碱对照品，购买信息详见表1；甲醇、甲酸、乙腈，均为色谱纯，购自美国欧姆尼公司；氨水、盐酸，购自国药集团化学试剂有限公司。

表1 钩吻生物碱对照品

1.1.3 试验仪器。试验仪器有MCX固相萃取柱（型号 CreoleMCX60mg/3mL，美国欧姆尼公司）；0.22 μm有机滤膜（美国欧姆尼公司）；三重四极杆液相质谱联用仪（Agilent 1290-QQQ6490，美国安捷伦公司）；电子天平（Quintix224-1，德国赛多利斯公司）；全自动平行浓缩仪（AutoEVA-60，睿科集团股份有限公司）；超纯水净化系统（UVF，英国ELGA PURELAB Classic公司）。

1.2 试验方法

1.2.1 对照品溶液制备。精密量取适量的11个钩吻生物碱标准品后，分别加入甲醇溶解配制成质量浓度为 4、10、20、40、100、200 ng/mL 混合溶液，作为本研究对照品溶液备用，对照品溶液均为现用现配。

1.2.2 钩吻总碱溶液制备。钩吻总碱溶液的制备方法见参考文献[4]。简述如下：将干燥的钩吻根、茎、叶和花粉碎过40目筛，分别称取3份，每份100.0 g，分别加入95%乙醇1 L、0.8 L和0.6 L进行浸泡，加热回流3次，每次2 h，减压过滤合并提取液，浓缩至无乙醇味。稀释至100 mL，并加入H2SO4调pH值至1，抽滤得到酸水液，用CH2Cl2萃取，取酸水层碱化，CH2Cl2萃取，取水层，加压浓缩后得到浸膏，减压干燥得到钩吻根、茎、叶和花4个部位的钩吻总碱。钩吻总碱用1%盐酸稀释至4%，超声提取30 min后离心（3 000 r/min）5 min，取上清液2.00 mL到已活化的MCX柱进行淋洗和洗脱，取洗脱液，用40℃氮吹至干燥，加入含0.1%甲酸的50%甲醇水1.00 mL溶解，0.22 μm有机滤膜滤过备用。

1.2.3 色谱条件。本试验采用Thermo Accucore aQ色谱柱（2.1 mm×100 mm，2.6 μm），以甲酸水（A）-乙腈（B）作为流动相，采用梯度洗脱方式，梯度设置为0～1.5 min（85%A）、1.5～2.0 min（55%A）、2.0～2.5 min（10%A）、2.5～3.5 min（0%A）、3.5～5.5 min（85%A），流速为0.40 mL/min，柱温为35℃。进样量控制为1 μL。

1.2.4 质谱条件。离子源是ESI源，参数设置如下：毛细管电压为3 500 V（正离子模式）；离子源温度为150℃；干燥气流量为15 L/min；雾化气压力为25 Psi；鞘气温度为350℃；鞘气（N2）流量为12 L/min。

1.3 统计处理

通过Graph Pad Prism 7.0软件，采用方差检验分析处理数据。

2 结果与分析

2.1 线性关系结果分析

根据以上色谱条件进行检测分析，以钩吻生物碱对照品溶液的质量浓度为横坐标（x）、离子扫描模式测得的质量数峰面积为纵坐标（y）建立线性回归方程，经计算分析后，钩吻素甲、钩吻素子、钩吻素戊、（Z）-阿枯米定碱、钩吻素己、钩吻绿碱、兰金断肠草碱、胡蔓藤碱乙、胡蔓藤碱丁、N-甲氧基无水老刺木碱二醇和常绿钩吻碱在一定浓度范围内存在良好的线性关系（表2）。

表2 11个钩吻生物碱的标准曲线

2.2 精密度、重现性和加样回收试验结果

分别取11种生物碱的对照品10 ng/mL，按上述仪器条件平行测定6次，计算它们的相对标准偏差；取钩吻总碱溶液，按上述仪器条件平行测定6次，计算重复性的相对标准偏差；取同一批钩吻总碱溶液，分别添加浓度为200、1 000 μg/kg的对照品，按上述仪器条件平行测定6次，计算回收率。11个钩吻生物碱检测的精密度、重复性、回收率试验结果见表3。它们的精密度相对标准偏差为1.1%～2.6%，表明仪器精密度良好；重复性相对标准偏差为2.1%～3.3%，表明该方法的重复性好；添加 200 μg/kg标准品的回收率为93.2%～98.8%，添加1 000 μg/kg标准品的回收率为94.4%～97.6%，符合标准要求。

表3 11个钩吻生物碱检测的精密度、重复性和回收率

2.3 不同部位的钩吻生物碱含量测定

对钩吻根、茎、叶和花4个部位的11种钩吻生物碱含量进行检测，结果见表4。4个部位钩吻生物碱含量从高到低依次是根＞叶＞花＞茎。从根的钩吻生物碱含量来看，11种生物碱的检出量从高到低依次为钩吻素甲＞钩吻素子＞钩吻绿碱＞钩吻素己＞胡蔓藤碱丁＞胡蔓藤碱乙＞（Z）-阿枯米定碱＞钩吻素戊＞N-甲氧基无水老刺木碱二醇＞兰金断肠草碱＞常绿钩吻碱。

表4 钩吻不同部位的11种生物碱含量比较 单位：（mg·g-1）

3 结论与讨论

钩吻4个部位的生物碱含量从高到低依次为根＞叶＞花＞茎。从根的钩吻生物碱含量来看，11种生物碱的检出量从高到低依次为钩吻素甲＞钩吻素子＞钩吻绿碱＞钩吻素己＞胡蔓藤碱丁＞胡蔓藤碱乙＞（Z）-阿枯米定碱＞钩吻素戊＞N-甲氧基无水老刺木碱二醇＞兰金断肠草碱＞常绿钩吻碱。说明钩吻根部是获取生物碱的最佳提取部位；根部含量较高的生物碱钩吻素甲、钩吻素子和钩吻素己可能是主要的药理和毒性活性成分。

本研究使用高效液相色谱-三重四极杆串联质谱法确定11种钩吻生物碱的含量，方法便捷灵敏、准确可靠，便于快速掌握钩吻的活性成分[4-5]。

钩吻是世界闻名的剧毒植物，具有良好的药用前景，生物碱是其主要活性成分。因此，有必要对钩吻的主要部位根、茎、叶和花的生物碱含量进行检测，为其合理高效应用奠定基础。本研究结果显示，钩吻根的生物碱含量最高，茎的含量最低，两者相差约10倍，叶和花的含量也不足根的1/3。在利用钩吻植物制备生物碱过程中，应尽量挑选钩吻根作为原料，若将该植物的各个部位混合进行制备，将会降低生物碱的产量。

在钩吻根中，含量最多的生物碱成分是钩吻素甲、钩吻素子、钩吻绿碱和钩吻素己。有研究发现，钩吻素子在中国钩吻生物碱检出量中最高，其次是钩吻素甲[2]，而本次研究的结果则与之存在一定的差异，这可能与钩吻产地、采摘时间和提取方法的差异有关。在这些含量较高的生物碱中，钩吻素甲、钩吻素子和钩吻素己相关的药理和毒性研究报道较多，这3种物质在镇痛和抗焦虑等方面表现较为突出，但钩吻素己的急性毒性最大[6-7]。综上所述，推断出钩吻素甲和钩吻素子具有较好的成药性，而钩吻素己则可作为研究钩吻中毒的代表性活性物质。