柱前衍生化高效液相色谱法分析大鼠体内D-丝氨酸和L-丝氨酸

型氨基酸主要位于哺乳动物的大脑皮层、海马和外周组织中，被认为是重要的生物标志物。-丝氨酸(-Ser)是中枢神经系统中-甲基--天冬氨酸受体的重要内源性配体，由-丝氨酸(-Ser)经丝氨酸消旋酶转化而来。-Ser是一种神经递质，参与突触传递、突触可塑性等生理功能的调节，与-甲基--天冬氨酸受体功能障碍相关的神经系统疾病有密切关系，如阿尔兹海默症、神经分裂症、抑郁症等。内源性-Ser水平的变化是当前神经生物学研究的热点，因此研究并建立内源性-Ser高效灵敏的检测方法对疾病预防和治疗、临床医学、神经生物学研究等具有重大意义。

大多数氨基酸不具有紫外或荧光信号，氨基酸分析仪通过柱后衍生可一次性检测多种氨基酸，但不能区分不同构型的氨基酸。生物体内的-Ser含量丰富，-Ser含量较低，且含有大量肽、胺类物质以及氨基酸，给-Ser的检测带来诸多干扰，目前常用的方法有毛细管电泳法、手性高效液相色谱法和酶分析方法，但这些方法均有缺点。本研究建立了以邻苯二甲醛(OPA)和-乙酰--半胱氨酸(NAC)衍生化高效液相色谱分离紫外检测的分析方法，具有操作简单、价格低、灵敏度高、适用性好等优势，可作为神经科学研究的有效技术和方法。此外，应用该方法测定了对照组和缺硒组大鼠血浆和脑组织中-Ser和-Ser含量，探究-Ser和-Ser与硒缺乏的关系，并可能为神经系统疾病的防治提供新的临床诊断手段。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

1260型高效液相色谱仪、DAD紫外检测器，美国安捷伦公司；BS210S电子天平，德国赛多利斯科学仪器(北京)有限公司；DELTA 320 pH计，梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司；多样品组织研磨仪，上海贺帆仪器有限公司；OPA、NAC，上海麦克林生化科技有限公司；-Ser、-Ser，Sigma-Aldrich公司；甲醇，色谱级，Merck公司；硼砂、醋酸铵，天津市康科德科技有限公司。

1.2 溶液的配制

1.2.1 标准溶液的配制 分别精密称取-Ser、-Ser 各0.050 0 g，用超纯水溶解并稀释到50 mL，配制成1 mg/mL的储备溶液。

1.2.2 衍生化试剂溶液的配制 分别精密称取OPA 0.050 0 g、NAC 0.050 0 g，用5 mL甲醇溶解，加入20 mL 0.1 mol/L的硼砂缓冲液(pH 9.8)混合均匀，使用前配制。

从表6可见，综合得分排在前4位的样方依次是11、12、6和8号样方。因为第一主成分代表多度，多度的方差贡献率最大，因此11号、12号样方以紫穗槐为优势种的植被多度最多，生态重建性最好。而10、5、2号样方分别以沙棘和白柠条为优势种的植被多度最低，生态重建性最差。

1.3 方法

NAC-OPA衍生化法的一个缺点是衍生产物存在不稳定性，以峰面积评价稳定性发现，衍生化产物在30 ℃条件下4 h内稳定性良好。低温可以延长衍生产物的稳定性，在4 ℃条件下12 h内稳定性良好。

1.3.4 液相色谱条件 色谱柱：Xbridge Amide column(250 mm × 4.6 mm，3.5 μm)；流动相：A：50 mmol/L醋酸铵，B：乙腈；流速：1.0 mL/min；柱温：35 ℃；检测波长：340 nm；进样量：10 μL；洗脱梯度见表1。

在上述衍生化条件和色谱条件下，-Ser 和-Ser得到很好地分离，如图1所示，皮质样品中-Ser和-Ser的分离度大于1.5，说明该色谱条件适合样品中-Ser与-Ser含量分析。

1.3.2 样品收集 实验至第532天，缺硒组和对照组各取5只大鼠，眼静脉丛取血0.5 mL，置于肝素钠抗凝的离心管中，1 520×g条件下离心10 min，分离上清得到血浆；大鼠断头后迅速在冰盘上分离大脑皮质、海马，将样本于-80 ℃保存，用于后续-Ser和-Ser含量的测定。

2 结果与讨论

2.1 系统适用性实验

1.3.3 样品处理与衍生化反应 (1)血浆：将360 μL甲醇加入到40 μL血浆中，涡旋5 min，8 100×g条件下离心10 min，取上清液350 μL在氮气下吹干，加入70 μL新鲜配制的衍生化试剂，涡旋反应5 min后于8 100×g条件下离心5 min，取上清液10 μL进样测定。(2)脑组织：精密称取0.050 0 g脑组织，加入1 mL甲醇，冰浴条件下组织匀浆，匀浆液在8 100×g条件下离心10 min，取上清液400 μL氮气下吹干，加入100 μL超纯水涡旋反应5 min后于8 100×g条件下离心5 min，取上清液40 μL，加入40 μL新鲜配制的衍生化试剂，涡旋反应5 min后于8 100×g条件下离心5 min，取上清液10 μL进样测定。

基于资源整合的农工商双向流通电商模式研究..................................................................................................................................尹 超 张明玉（69）

冰浴条件下制备脑组织提取液，分别加入不同浓度水平的-Ser和-Ser的标准品，衍生化并离心分离后进样测定。每个浓度3个样本，计算方法回收率，结果见表2。方法回收率为97.29%～101.88%，相对标准偏差小于5.87%。

2.2 线性关系和定量下限

分别用储备液配制-Ser和-Ser混合标准品溶液，即-Ser为 4、6、12、18、22、28 μg/mL系列标准溶液；-Ser为16、24、48、64、80、112 μg/mL系列标准溶液。分别取各标准溶液50 μL与等体积衍生化试剂衍生化后测定。以峰面积为纵坐标(Y)、标准品溶液的浓度为横坐标(X)，绘制标准曲线。分别得到-Ser和-Ser的回归方程为：Y=14.946X-18.496(=0.998 2)、Y=12.339X-44.555(=0.999 4)。结果表明，-Ser在2～14 μg/mL的范围，-Ser在8～56 μg/mL范围内具有良好的线性关系。以10倍信噪比计算定量限，-Ser和-Ser的定量限为0.04 μg/mL。

近年来还有研究提出，将右美托咪定等药物作为神经阻滞的辅助用药可显著增长术后镇痛时效，并降低术后阿片类药物的用量[10]，但是需要权衡镇痛时效延长与相关血流动力学副作用，在临床上应审慎对待。

2.3 稳定性

1.3.1 动物实验 3 w龄断乳雄性Sprague-Dawley大鼠10只，体重(48.3±5.9)g，采购于三峡大学实验动物中心，生产许可证号为SCXK(鄂)2017-0012。将大鼠分为缺硒组(SD组，=5)、对照组(SS组，=5)，缺硒组饲喂低硒饲粮(含0.02 mg Se/kg饲粮)，正常组饲喂正常饲粮(含0.18 mg Se/kg饲粮)。低硒饲粮按照AIN-93标准配制，正常饲粮是在低硒饲粮的基础上添加亚硒酸钠制成。大鼠饲养环境温度为(20±2)℃，相对湿度为55%～65%，自由饮食。

开学第二天清晨，高三全体学生在操场上集合宣誓。黎明前的空中，还残留着一些凛冽的夜色，但天空慢慢就被红光占领，太阳就要升起了。

2.4 回收率

(3)政府激励政策有效，相应的政策法规出台和宣传所花费的成本为C1；政府激励政策有效，购房者响应政府号召，积极购买和使用被动房，政府对这些购房者进行奖励所花费的成本C2，购房者购买被动房的额外增量成本C3。

2.5 精密度

冰浴条件下制备脑组织提取液，分别加入240 μg/mL的-Ser和60 μg/mL的-Ser的标准品10 μL，加入50 μL衍生化试剂，涡旋反应5 min后8100×g离心5 min，取上清液置于液相小瓶中，进样检测峰面积。重复衍生化反应及后续步骤，测定6次，计算得到峰面积的RSD值为1.63%和1.83%，表明精密度良好。

2.6 方法学应用

用上述建立的方法检测对照组和缺硒组大鼠血浆、大脑皮质和海马组织中-Ser和-Ser含量。结果如图2所示，与对照组相比，缺硒组大脑皮质和海马中-Ser和-Ser含量无明显差异，血浆中-Ser含量显著升高(<0.05)，-Ser含量无显著变化。血浆中-Ser含量有可能与硒缺乏有关。

3 结论

本研究建立了NAC-OPA柱前衍生化法反相液相色谱紫外检测测定大鼠血浆和脑组织中-Ser和-Ser的方法，该方法快速、灵敏、专属性好、检测时间短、应用范围广。经方法学验证该方法的精密度、稳定性、线性关系、加样回收率均良好，适用于动物血浆和脑组织中-Ser和-Ser的同时检测，为硒缺乏与神经系统疾病的进一步研究提供方法学参考。