通过式固相萃取-超高效液相色谱串联质谱法同时测定猪肝中19种磺胺类兽药残留

王展华，王一涵，施 贝，张文萍，朱蕾颖，张翀宇

(国家市场监管重点实验室(功能食品质量与安全领域)，浙江省市场局重点实验室(保健品质量安全重点实验室)，浙江省食品药品检验研究院，浙江杭州 310052)

磺胺类药物(sulfonamides，SAs)是一种以对位氨基苯磺酰胺(简称磺胺)为基本结构的药物。磺胺类药物具有抗菌谱广、抗菌能力强、毒性小、易吸收、价格便宜等优点。由于磺胺药的抗菌机理为抑制微生物生长，高投药量能够明显增加抑菌效果，为了达到抑菌效果，养殖户在实际使用中存在滥用磺胺类药物的现象。磺胺类药物通过食品链进行富集，会导致消费者产生过敏反应、肾脏损害、中枢神经系统和胃肠道反应。为了保障我国人民的食品安全，目前我国国家标准GB 31650—2019《食品安全国家标准食品中兽药最大残留限量》中规定了动物源性食品中磺胺总量的最高残留不得高于100 μg/kg。

目前用于动物性食品中磺胺类药物残留检测的方法主要有液相色谱法(HPLC)、酶联免疫法(ELISA)、液相质谱联用法(HPLC-MS)。近年来，液相质谱联用法因其检出限度低、定量定性准确，成为动物源性食品中兽药残留检测应用最为广泛的技术。用于液相质谱联用法检测的样品前处理技术主要有液液萃取、固相萃取。其中固相萃取又分为基质分散固相萃取、吸附-洗脱式固相萃取、通过式固相萃取。基质分散固相萃取主要用于简单基质的净化，用于动物源性样品净化需要使用专用增强型脂质型净化材料，检测成本较高，而且按样品性质按比例配制净化材料用量，对于不同基质的样品通用性不强。吸附-洗脱式固相萃取是目前应用最广泛的固相萃取净化技术，在动物源性药物残留的检测中，通常使用水相提取溶液，净化需经过固相萃取柱活化、上样、淋洗、洗脱等步骤，由于动物源样品的水相提取液中会含有游离脂肪和蛋白质等大分子物质，在上样、淋洗、洗脱步骤中极易堵塞固相萃取柱，导致试验时间延长和样品回收率不稳定。通过式固相萃取是一种新型的固相萃取技术，在直接上样、接收的同时又能够有效保证去除基质干扰，有效地解决了常规吸附-洗脱式固相萃取、步骤烦琐、耗时长的缺点。笔者选取日常监督抽检中需要检测的19种磺胺类药物，以基质较为复杂的猪肝为研究基质，建立通过式固相萃取-超高效液相色谱串联质谱法同时测定猪肝中19种磺胺类兽药残留的方法，并完成方法的稳定性和适应性的研究，以期满足日常监督抽检中动物源性食品中磺胺类药物快速检测的需要，同时对动物源性磺胺类药物残留检测标准制定和更新具有重要的借鉴意义。

1 材料与方法

试剂。标准品：乙酰磺胺(纯度99.0%)、磺胺吡啶(纯度99.0%)、磺胺嘧啶(纯度99.0%)、磺胺甲噁唑(纯度99.6%)、磺胺噻唑(纯度99.5%)、磺胺甲嘧啶(纯度99.5%)、磺胺二甲异噁唑(纯度99.8%)、磺胺甲噻二唑(纯度99.4%)、苯甲酰磺胺(纯度99.3%)、磺胺二甲异嘧啶(纯度99.0%)、磺胺甲氧哒嗪(纯度99.2%)、磺胺氯哒嗪(纯度99.1%)、磺胺邻二甲氧嘧啶(纯度98.0%)、磺胺间二甲氧嘧啶(纯度99.5%)、磺胺苯吡唑(纯度99.8%),德国Dr.Ehrenstorfer公司；磺胺对甲氧嘧啶(纯度99.5%)、磺胺间甲氧嘧啶(纯度97.5%)，中国食品药品检定研究院；磺胺二甲嘧啶(纯度100.0%)，中国药品生物制品检定所；酞磺胺噻唑(纯度99.7%)，北京安谱公司。磺胺类药物混合标准储备液(浓度100 mg/L)，北京曼哈格公司。甲醇、乙腈(质谱纯，德国Merck公司)；甲酸(色谱纯，美国sigma 公司)；ProElut PLS-A(200 mg，6 mL)固相萃取柱(北京迪马公司)；Waters Acquity BEH C色谱柱(100 mm×2.1 mm，1.7 μm，美国Waters公司)；ACQUITY UPLC HSS T3 色谱柱(100 mm×2.1 mm，1.8 μm，美国Waters公司)；0.22 μm PTFE过滤头(美国Agilent公司)。

试材。猪肝样品购于浙江省内不同农贸市场。

仪器与设备。Shimadzu LC-30A高效液相色谱仪(日本岛津公司)；SCIEX Triple Quad 5500-QTRAP Activated质谱仪(美国ABSciex公司)；Milli-Q超纯水仪(德国默克密理博公司)；LYNX 6000 超速离心机(美国热电公司)；XPE205分析天平(瑞士梅特勒公司)；MultiReax多通道旋涡混合器(德国Heidolph公司)。

标准溶液的配制。

磺胺类药物单标标准储备液的配制。准确称取乙酰磺胺、磺胺吡啶等19种标准品分别置于10 mL容量瓶中，用乙腈溶解后定容，配成1 mg/mL的磺胺类药物储备液，在-18 ℃冷冻保存。

磺胺类药物单标标准工作液的配制。分别精密移取25 μL标准储备液，用初始流动相稀释至50 mL，配成500 μg/L的磺胺类药物中间液，使用时，分别精密移取各单标中间液用初始流动相稀释至所需浓度。

磺胺类药物标准混合工作液的配制。精密量取100 μL 磺胺类药物混合标准储备液，用初始流动相稀释至10 mL，配成1 mg/L磺胺类药物中间液，使用时，分别精密移取适量的中间液，用空白基质稀释至所需质量浓度，配制成混合标准工作液。

样品前处理。精密称取5 g均质后的试样于50 mL离心管中，加入乙腈-水(=80/20)20.0 mL，超声提取10 min后，于MultiReax多通道旋涡混合器中涡旋提取30 min，6 000 r/min 高速离心20 min，取4.0 mL上清液过ProElut PLS-A固相萃取柱后，用2.0 mL乙腈-水(=80/20)淋洗，收集全部流出液。将全部流出液45 ℃下氮吹近干，1.0 mL甲醇-乙腈-水混合溶液(=1/1/18)复溶，复溶液使用0.22 PTFE过滤头过滤至进样瓶，待测。

色谱质谱条件。

色谱条件。岛津LC-30AD超高效液相色谱系统串联Applied Biosystems Qtrap 5500三重四级杆质谱仪，包括二元泵，在线脱气，自动进样器；色谱柱为Waters Acquity BEH C(100 mm×2.1 mm，1.7 μm)；柱温35 ℃；流动相为0.1%甲酸混合水溶液(A)和0.1%甲酸甲醇-乙腈混合溶液(=1/1)(B)；梯度洗脱程序：0～2 min，10%B，2～8 min，10%～80%B，8～11 min，80%～10%B；流速0.35 mL/min；进样量2 μL。

质谱条件。离子源为TurboV 电喷雾(ESI)离子源；电离方式为正离子；雾化电压(IS)5 500 V；离子源温度(TEM)500 ℃；雾化气压力(GS1)275.79 kPa；辅助加热气压力(GS2)275.79 kPa；碰撞室入口电压(EP)10 V；碰撞室出口电压(CXP)13 V；碰撞电压(CE)、去簇电压(DP)、定性离子对、定量离子对见表1。

表1 磺胺类药物保留时间、定性、定量离子对及碰撞电压和去簇电压

接下表

2 结果与分析

分离色谱柱的选择。选择ACQUITY UPLC HSS T3色谱柱(100 mm×2.1 mm，1.8 μm)和Waters ACQUITY UPLC BEH-C色谱柱(100 mm×2.1 mm，1.7 μm)进行分离试验，结果发现，使用ACQUITY UPLC HSS T3色谱柱(100 mm×2.1 mm，1.8 μm)进行分离时，3种同分异构体(磺胺间甲氧嘧啶、磺胺甲氧哒嗪、磺胺对甲氧嘧啶)在该色谱柱不能得到很好分离；而使用Waters ACQUITY UPLC BEH-C色谱柱，3种同分异构体分离良好且峰型良好，响应较高。Waters ACQUITY UPLC BEH-C属于端基封尾的色谱柱，可以改善峰形，且耐受pH也更广。因此，该研究最终选择Waters ACQUITY UPLC BEH-C色谱柱作为分离柱。

液相色谱条件的优化。在现有液相色谱检测磺胺类药物的研究方法中均采用了甲醇、乙腈为有机相和0.1%甲酸水为水相，该研究对比了甲醇+0.1%甲酸水、乙腈+0.1%甲酸水，发现在有机相为乙腈的情况下，磺胺对甲氧嘧啶、磺胺甲氧哒嗪、磺胺间甲氧嘧啶这3个同分异构体无法有效分离，而有机相为甲醇时，磺胺间二甲氧嘧啶、磺胺苯吡唑等出峰时间较晚，最终采用了0.1%甲酸混合水溶液(A)和0.1%甲酸甲醇-乙腈混合溶液(=1/1)(B)，在此流动相条件下19种物质均能很好的分离。该研究进一步对梯度洗脱条件进行了优化，发现待测目标物均良好分离，多反应监测提取离子流图见图1。

磺胺类药物适合在电喷雾离子源(ESI)的正离子模式下进行检测，使用500 μg/L的磺胺类药物中间液，使用Analysis软件在正离子模式扫描下，根据相应物质的分子量确定一级质谱的扫描范围，分别进行一级质谱扫描找到母离子，进行二级质谱扫描确定出2～3个相应较高的子离子，最后通过多反应检测扫描优化相应质谱参数。优化结果见表1。

该研究选取了ProElut PLS-A(200 mg，6 mL)和ProElut PLS(200 mg，6 mL)2种固相萃取柱进行了比较净化，其中ProElut PLS(200 mg，6 mL)固相萃取柱是国家标准GB 31658.17—2021中推荐使用的亲水亲脂平衡固相萃取柱，采用的净化模式是吸附-洗脱模式，该模式在实际操作过程中样品容易堵塞固相萃取柱，导致试验时间较长，而ProElut PLS-A采用直接通过模式，无吸附系统过程，缩短了试验时间。结果发现，使用ProElut PLS固相萃取柱对猪肝样品进行净化的回收率普遍低于ProElut PLS-A固相萃取柱的样品。该研究使用ProElut PLS-A固相萃取柱对样品进行净化。

磺胺类药物为极性物质，常用的甲醇乙腈对磺胺类药物均有较好的提取效果。与甲醇相比，乙腈可以有效地沉淀蛋白质，且乙腈对糖类和脂肪的溶解度低于甲醇，该研究采用乙腈为提取溶剂。有研究表明，当乙腈水溶液浓度小于60%时无法使蛋白质完全变性，而使用纯乙腈，样品外部蛋白质快速变性，产生包裹效应，使组织内部的药物无法被充分提取。经综合考虑，该研究中采用80%的乙腈水溶液作为提取溶剂。

该研究采用空白基质添加标准溶液的峰面积(A)与初始流动相中标准物质的峰面积(B)考察基质效应

图1 19种化合物的提取离子流图Fig.1 Extracted ion chromatograms of 19 compounds

(ME)。试验结果(图2)表明，净化过的样品依然存在基质效应，目前消除基质效应的方法有同位素稀释和基质标准曲线2种方法，在该研究中使用基质标准曲线的方法来消除基质效应。

采用混合标准工作液使用空白基质配制成2～80 μg/L的系列标准溶液，线性回归方程及相关系数见表2。结果表明，磺胺类药物在猪肝基质中在2～80 μg/L线性关系良好(>099)；在5 g空白猪肝基质样品中加入500 μL混合标准工作液(1 000 μg/L)，理论加标浓度为10.0 μg/kg，按照已建立方法检测，信噪比>10为定量限，信噪比>3为检出限。从表2可以看出，该方法的19种磺胺类药物的定量限远低于GB 31658.17—2021规定的标准要求(10 μg/kg)，可满足日常监督检测的需求。

图2 19种磺胺类药物在猪肝脏基质中的基质效应Fig.2 Matrix effects of 19 sulfonamides in porcine liver matrix

表2 19种磺胺类药物的线性方程、决定系数、检出限和定量限

分别选取了3个浓度梯度水平对空白样品进行加标试验，每个浓度水平测定6次，计算加标回收率和RSD值，检验结果如表3所示。19种磺胺类药物在猪肝样品中的回收率为74.0%～123.2%，RSD均小于10%，表明该方法稳定、可靠。

利用建立的方法对杭州市售猪肝样品20批次进行19种磺胺药物残留检测，测定结果均为未检出，说明目前杭州市售猪肝质量较好。

3 结论

该研究建立了通过式固相萃取-超高效液相色谱串联质谱法同时测定猪肝中19种磺胺类兽药残留的方法。猪肝中19种磺胺类药物在方法的液相条件下均得到了很好的分离，同时方法采用的通过式ProElut PLS-A固相萃取柱的净化方法减少了试验步骤，节约了样品处理所需要的时间。经试验方法学验证，该方法检出限、回收率、精密度均优于现行国家标准，适用于大批量动物源性食品中磺胺类药物残留的快速筛查和定量。

表3 19种磺胺类药物的加标回收率及其RSD(n=6)