库车市牛场十二指肠贾第虫和隐孢子虫的分子检测与鉴定

徐春艳，张宽宽，王正荣，黄忠武，井 波，张艳艳，余复昌，齐 萌*

(1.塔里木大学动物科学与技术学院，新疆生产建设兵团塔里木动物疫病诊断与防控工程实验室，新疆阿拉尔 843300；2.新疆农垦科学院畜牧兽医研究所，新疆石河子 832000；3.库车市兽医站，新疆库车 842000)

十二指肠贾第虫(Giardiaduodenalis)和隐孢子虫(Cryptosporidium)是引起人和动物腹泻的常见原虫，主要通过食源性和水源性传播[1-2]。基于分子生物学鉴定方法，十二指肠贾第虫划分为8个集聚体(Assemblage A-H)，其中，集聚体A和集聚体B具有人兽共患性，反刍动物主要感染集聚体E[3]。牛常见感染的隐孢子虫有微小隐孢子虫(Cryptosporidiumparvum)、牛隐孢子虫(C.bovis)、安氏隐孢子虫(C.andersoni)和芮氏隐孢子虫(C.ryanae)，不同种类的感染情况与牛的年龄存在相关性[4]。在我国，牛十二指肠贾第虫感染率在0.1%～74.2%，总体上奶牛的十二指肠贾第虫感染率高于肉牛[1]。近年来，在宁夏回族自治区和江苏省等地牛场犊牛因暴发隐孢子虫病而造成较大的经济损失[5]。本调查旨在了解和掌握库车市规模化场牛十二指肠贾第虫和隐孢子虫的感染情况和种类分布，为新疆地区牛肠道寄生原虫病的研究提供基础数据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 牛粪便样本采集 在新疆库车市1个存栏量为246头的奶牛场和1个存栏量为408头的肉牛场，随机选取奶牛37头、肉牛61头。其中，犊牛(<6月龄)、育成牛(7～12月龄)和成年牛(>12月龄牛)分别为14头、23头和61头。待牛排出粪便后，立即使用一次性乳胶手套收集粪便样本，单独装入洁净采样袋中，每份10 g～30 g，记录信息，带回实验室，置4℃冰箱中保存，1周内提取DNA。

1.1.2 主要试剂 粪便全基因组DNA提取试剂盒，美国OMEGA Bio-Tek公司产品；2×EasyTaqPCR SuperMix (+dye)、DNA Marker DL 2 000，北京全式金生物技术有限公司产品；rTaq酶、限制性内切酶SspⅠ和MboⅡ，宝日医生物技术有限公司产品。

1.1.3 主要仪器 Sorvall Legend Micro 17型微量离心机，Thermo Scientific公司产品；MC proS型梯度PCR仪，Eppendorf公司产品；DYY-7C型稳压稳流电泳仪、JY系列电泳槽，均为北京六一生物科技有限公司产品；Gel Doc XR+型凝胶成像系统，Bio-Rad公司产品。

1.2 方法

1.2.1 提取粪便样本DNA 每份粪便样本挑取约200 mg，按试剂盒操作步骤提取全基因组DNA，置-20℃冰箱中保存待测。

1.2.2 引物设计和PCR扩增 参考张盈等[6]报道设计扩增十二指肠贾第虫和隐孢子虫的小亚基核糖体RNA(SSUrRNA)基因的引物；参考Alves等[7]设计扩增微小隐孢子虫表面糖蛋白gp60(cell surface glycoproteins gp60)基因的引物，由苏州金维智生物科技有限公司合成。引物序列、目的片段和退火温度见表1。隐孢子虫SSUrRNA基因和gp60基因扩增的PCR反应体系为25 μL：模板DNA 1 μL，2×EasyTaqPCR SuperMix(+dye)12.5 μL，上、下游引物(20 μmol/L)各0.3 μL，双蒸水10.9 μL。十二指肠贾第虫的PCR反应体系为25 μL：模板DNA1 μL，10×buffer 2.5 μL，dNTPs 2 μL，rTaq酶0.15 μL，上、下游引物(20 μmol/L)各0.3 μL，二甲基亚砜(DMSO)1.25 μL，双蒸水17.5 μL。每次PCR扩增均设阳性对照和阴性对照，阳性DNA对照样本为鸡源贝氏隐孢子虫和马源十二指肠贾第虫集聚体B，由塔里木大学兽医寄生虫学实验室鉴定保存，阴性对照为双蒸水。PCR反应结束后，取5 μL PCR产物于10 g/L的琼脂糖凝胶中电泳检查结果。

表1 用于十二指肠贾第虫和隐孢子虫鉴定的引物序列、目的片段、退火温度Table 1 Primer sequences,fragment lengths and annealing temperatures used in the detections of G.duodenalis and Cryptosporidium spp.

1.2.3 隐孢子虫限制性片段长度多态性鉴定 基于SSUrRNA基因序列扩增呈隐孢子虫阳性的样本，分别取其8 μL PCR产物，加入14 μL双蒸水和2 μL酶切缓冲液，分别加入1 μLSspⅠ酶或MboⅡ酶，于37℃水浴孵育4 h，取8 μL酶切产物于10 g/L的琼脂糖凝胶中电泳检查结果，参照文献[8]对隐孢子虫进行限制性片段长度多态性(restriction fragment length polymorphism,RFLP)鉴定。

1.2.4 序列对比和集聚体/基因亚型鉴定 将PCR扩增阳性产物送至苏州金唯智科技有限公司进行双向测序。在GenBank数据库中进行Blast搜索，下载参考序列，使用Clustalx 2.1软件比对和校准序列，根据序列分析结果鉴定隐孢子虫种类/基因亚型、十二指肠贾第虫集聚体。

2 结果

2.1 牛十二指肠贾第虫和隐孢子虫感染情况

对98份样本进行PCR检测，其中33份样本呈十二指肠贾第虫和隐孢子虫阳性，总感染率为33.7%(33/98)；其中十二指肠贾第虫阳性样本31份，感染率为31.6%(31/98)，隐孢子虫阳性样本10份，感染率为10.2%(10/98)；十二指肠贾第虫和隐孢子虫混合感染阳性样本8份，混合感染率为8.2%(8/98)。

奶牛的十二指肠贾第虫和隐孢子虫总感染率为56.8%(21/37)，其中有8份为十二指肠贾第虫和安氏隐孢子虫混合感染；其十二指肠贾第虫和隐孢子虫阳性样本数分别为19份和10份，感染率分别为51.4%(19/37)和27.0%(10/37)。肉牛的十二指肠贾第虫和隐孢子虫总感染率为19.7%(12/61)，均为十二指肠贾第虫感染，未发现隐孢子虫感染。

2.2 不同年龄段牛十二指肠贾第虫和隐孢子虫感染情况

以<6月龄牛十二指肠贾第虫和隐孢子虫感染率较高，为85.7%(12/14)，7～12月龄和>12月龄牛的感染率分别为21.7%(5/23)和26.2%(16/61)。<6月龄牛隐孢子虫感染率为57.1%(8/14)，高于>12月龄牛的感染率(3.3%，2/61)，7～12月龄牛未发现隐孢子虫感染。<6月龄牛十二指肠贾第虫感染率为71.4%(10/14)，高于>12月龄牛的感染率(24.5%，15/61)和7～12月龄牛的感染率(21.7%，5/23)。

2.3 牛十二指肠贾第虫和隐孢子虫种类/基因型分布情况

将31份呈十二指肠贾第虫阳性的PCR产物进行双向测序，均成功获得序列，经比对分析，30条序列与我国山东牛源集聚体E(MN593002)相似性为100%，鉴定为集聚体E；1条序列与我国新疆马源集聚体B(MN174122)相似性为100%，鉴定为集聚体B。将10份呈隐孢子虫阳性的PCR产物进行双酶切鉴定，鉴定出8份为安氏隐孢子虫，1份为微小隐孢子虫和芮氏隐孢子虫混合感染，1份为牛隐孢子虫和芮氏隐孢子虫混合感染。进一步基于gp60位点扩增微小隐孢子虫阳性样本进行亚型鉴定，测序成功获得双向序列，经比对分析，该序列与我国上海山羊源微小隐孢子虫IIdA19G1亚型(KM199738)相似性为100%，鉴定为IIdA19G1亚型。

3 讨论

本次调查发现，库车市规模化场牛十二指肠贾第虫感染率为31.6%(31/98)，各年龄段均有感染，以集聚体E为主要感染集聚体，同时发现感染集聚体B。全球范围内，牛常见感染十二指肠贾第虫集聚体A、B和E，其中E在大多数国家和地区牛感染的优势集聚体[9]。陈功义等[10]调查发现，中牟地区规模化场奶牛十二指肠贾第虫感染率为6.7%(29/422)，其感染率呈现随年龄增长而降低的趋势。研究发现，同一地区奶牛十二指肠贾第虫阳性率存在差异，如在广东省开展的2项调查研究中，规模化场奶牛十二指肠贾第虫的感染率分别为74.2%(288/388)和2.2%(31/1440)；在四川省开展的2项调查研究中，规模化场奶牛十二指肠贾第虫的感染率分别为41.2%(126/306)和9.4%(26/278)[1]。本次调查显示，奶牛和肉牛十二指肠贾第虫感染率分别为51.4%(19/37)和19.7%(12/61)，感染率存在差异与其饲养模式和年龄分布有一定关系，奶牛场为自繁自育，而肉牛场多是购进育肥牛；幼龄牛十二指肠贾第虫感染率高于育肥牛和成年牛，与文献报道一致，呈现随年龄增长而降低的趋势。

研究显示，牛的隐孢子虫感染率和感染种类/基因型与年龄、季节、饲养管理、地理条件、生物安全防控以及样本采集的时间和方法等诸多因素有关[11]。郑双健等[12]调查发现郑州地区规模化场奶牛隐孢子虫总感染率为2.8%(27/973)，以断奶前犊牛感染率较高，为7.1%(12/169)。王臣荣等[13]调查发现某规模化引种场进口奶牛隐孢子虫总感染率为17.8%(90/507)，以断奶前犊牛感染率较高，为38.8%(64/165)，隐孢子虫感染率随年龄增长呈下降趋势。林洁等[14]报道渝西地区奶牛源隐孢子虫PCR阳性扩增产物经SspⅠ和MboⅡ酶切后进行RFLP分析，鉴定出安氏隐孢子虫、牛隐孢子虫和芮氏隐孢子虫，以安氏隐孢子虫为优势虫种。Tao等[15]报道我国北方四省的奶牛感染微小隐孢子虫、芮氏隐孢子虫、牛隐孢子虫和安氏隐孢子虫4种隐孢子虫，其中微小隐孢子虫仅感染断奶前犊牛。本次调查发现，库车市规模化场牛的隐孢子虫感染率为10.2%(10/98)，以<6月龄牛隐孢子虫感染率较高，为57.1%(8/14)，以安氏隐孢子虫为主要感染种类，微小隐孢子虫感染幼龄牛，与上述报道结果相一致。

牛感染十二指肠贾第虫和隐孢子虫后，一方面可导致牛腹泻和营养不良等症状，影响养牛业的经济效益；另一方面存在一定的人兽共患风险，具有公共卫生意义。随着养牛业逐渐向集约化规模化发展，应进一步加强牛十二指肠贾第虫和隐孢子虫的检测与防治工作。