牛冠状病毒的全基因组测序及遗传进化分析

寇美玲，谢佳芮，杨佳萍，苗海生

(1.云南省畜牧兽医科学院，云南省热带亚热带动物病毒病重点实验室，云南昆明 650224；2.施甸县畜牧兽医中心，云南保山 678200)

冠状病毒属于单股正链RNA病毒，基因组长度约为30 000 bp，为目前已知的最大的RNA病毒。冠状病毒家族根据形态、基因组结构和基因表达情况分为2个亚科，即冠状病毒亚科(Coronavirinae)和凸隆病毒亚科(Torovirinae)[1]。在遗传和血清学特性基础上，Coronavirinae亚科又被划分成4个属，即α、β、γ和δ冠状病毒属[2]。每个属再根据pp1ab复制酶结构域不同划分成不同物种。其中β冠状病毒是分型比较复杂的一个属，现在分为 4 个亚群(A、B、C 和 D)。目前流行的新型冠状病毒COVID-19和2003年发生的SARS病毒均为β病毒属B亚群[3]。

牛冠状病毒(Bovine coronavirus，BCoV)可以引起新生犊牛腹泻、成年牛的冬季血痢和呼吸道疾病，呈世界性分布。BCoV属于β病毒属A亚群，有囊膜，基因组主要包括2个开放阅读框ORF1a、ORF1b和5个编码结构蛋白的基因。结构蛋白分别为血凝素酯酶蛋白(HE)、纤突蛋白(S)、小衣壳蛋白(E)、膜蛋白(M)、核衣壳蛋白(N)[4]。HE蛋白主要参与病毒的早期吸附作用[5]；S蛋白介导细胞的吸附和病毒与膜的融合，与病毒的毒力和组织受体识别有关，是病毒感染宿主范围和跨物种感染的重要决定因素[6]；N蛋白与RNA组成核糖核蛋白复合体，可作为诊断CoV检测的靶点，也可作为诊断抗原用于BCoV流行病学调查[7-8]；M蛋白在病毒装配中起重要作用，N蛋白与其羧基末端亲水氨基酸结合，影响和决定病毒的出芽过程[9]。

云南省热带亚热带动物病毒病重点实验室对2019年1月～12月采集的牛食道-咽喉部分泌物(OP液)样品进行BCoV核酸筛查，检出核酸阳性样品1份，该样品采集自云南省景洪市勐龙镇曼景勐村委会，经调查该牛是经景洪市中缅边境入境的缅甸黄牛，在该村短期育肥，其他牛未检出BCoV核酸，缅甸来源地已无法查证。本文对检出的BCoV进行全基因测序和遗传进化分析，并对HE、S、M、N基因片段分别进行分析，以期对国内的BCoV预防和控制提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样品 2019年1月～12月在景洪市采集黄牛食道咽喉部分泌物(OP液)214份，置于10 mL离心管中，并向离心管中加入保存液(生理盐水+甘油)混匀，置-80℃备用。

1.1.2 主要试剂 核酸提取试剂盒，ABI Magmax磁珠法，美国应用生物系统(ABI)公司产品；一步法RT-PCR检测试剂盒和化学试剂，宝生物工程(大连)有限公司产品。

1.1.3 主要仪器 旋涡混合器(QL861),江苏其林贝尔公司产品；PCR扩增仪(9700)，凝胶成像系统，美国应用生物系统(ABI)公司产品；多功能水平电泳槽(HE-120)，上海天能公司产品。

1.2 方法

1.2.1 RNA的提取 参照ABI Magmax磁珠法核酸提取试剂盒说明书对OP液样品提取RNA，将所提取的RNA存放于-80℃超低温冰箱保存备用。

1.2.2 病毒鉴定引物合成 根据GenBank中公开发表的BCoV S基因序列设计引物，由昆明擎科公司合成引物(表1)[4]。

表1 BCoV S基因引物序列Table 1 Primer sequences of BCoV S gene

1.2.3 BCoV全基因引物序列 根据BCoV-giraffe coronavirus US/OH3/2006(EF424624.1)毒株全基因序列设计20对引物，引物由昆明擎科公司合成(表2)。

表2 BCoV全基因引物序列Table 2 BCoV full length primer sequences

1.2.4 病毒鉴定 针对BCoV S蛋白基因片段进行RT-PCR反应。反应体系25 μL：RNA 5 μL，2×1 step Buffer(Dye Plus) 12.5 μL，PrimeScript 1 step Enzyme Mix 1.0 μL，BCoV S基因引物各0.5 μL，RNase free dH2O 5.5 μL。反应条件：50℃ 6 min；94℃ 2 min；94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 1 min，32个循环；72℃ 5 min。10 g/L琼脂糖电泳检查扩增条带。

1.2.5 病毒全基因组序列扩增 经RT-PCR对S蛋白基因片段检测、测序鉴定为BCoV的样品进行全基因组测序。应用一步法RT-PCR检测试剂盒进行检测，反应体系25 μL：RNA 5 μL，2×1 step Buffer(Dye Plus) 12.5 μL ，PrimeScript 1 step Enzyme Mix 1.0 μL，各基因引物各0.5 μL，RNase free dH2O 5.5 μL。反应条件：50℃ 6 min；94℃ 2 min；94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 1.5 min，32个循环；72℃ 7 min。对扩增产物进行正反双向测序，应用Seqman软件进行拼接，获得全基因组序列。

1.2.6 BCoV S基因、全基因序列分析 在NCBI上进行序列比对，并从GenBank上下载冠状病毒基因组序列，应用MAEGA6.0进行多个序列比较分析。分析内容涉及全基因组和HE、S、M、N结构蛋白基因片段。

2 结果

2.1 样品鉴定

2.1.1 样品RT-PCR鉴定 应用RT-PCR方法对牛OP液样品进行BCoV S蛋白基因片段鉴定，同时设置阴性、阳性对照，阳性对照为含有目的片段的质粒。电泳结果显示，样品片段大小为622 bp，与目的片段大小一致(图1)，初步断定为冠状病毒β属A亚群的BCoV。

M.DNA标准DL 2 000；1.阳性对照；2.阴性对照；3.样品M.DNA Marker DL 2000；1.Positive control；2.Negative control；3.Sample图1 S基因部分片段电泳图Fig.1 S Gene fragment electrophoresis map

2.1.2 BCoV S基因遗传进化 采用Mega 6.0软件对云南景洪检测到的1株BCoV与GenBank中11株BCoV一起构建S基因系统进化树(图2)，对比结果显示，本次检测到的样品与中国、越南、美国、瑞典等国家分离的样品形成一个大簇，归为冠状病毒β属A亚群；中国分离到的BCoV可形成2个独立的簇，归为冠状病毒β属B亚群和D亚群；再次判定该样品为β属A亚群的BCoV。

图2 冠状病毒S基因部分片段遗传进化分析Fig.2 Genetic evolution analysis of the S gene fragment of coronavirus

2.2 全基因组序列分析

应用一代测序方法对病毒进行全基因组测序，并在GenBank下载冠状病毒不同亚型全基因代表毒株进行比对和遗传进化分析。全基因组分析结果显示，本次检出的BCov/YNJH/CHA/96/2019毒株属典型的Beta CoV A亚群,cDNA与美国毒株US/OH3/2006相似性最高，为99.33%，与美国2018年毒株Bovine coronavirus 4-17-08相似性为99.29%，与人源HCoV OC43毒株亲缘关系较近，但保持一定距离，与COVID-19和SARS毒株无关联。

2.3 HE基因组序列分析

HE基因序列分析显示，该毒株与美国毒株US/OH3/2006、Sable antelope US/OH1/2003、Giraffe US/OH3-TC/2006相似性最高，均为99.29%。该基因相似度与全基因组比较结果类似，属美国BCoV基因群，但HE基因组出现变异。

2.4 S蛋白基因组序列分析

S蛋白基因全序列分析显示，该病毒与中国四川奶牛SWUN/LN2/2018毒株和美国宾夕法尼亚州黄牛4-17-08毒株S基因相似性最高，均为99.36%，其次与美国US/OH1/2003相似性为99.02%。由于未找到SWUN/LN2/2018全基因组数据，因此不能断定二者的同缘关系，由于S蛋白是冠状病毒重要的受体结合和膜活性结构蛋白，因此判断该毒株在毒力上与上述2种毒株可能最为接近。

图3 冠状病毒全基因遗传进化分析Fig.3 Genetic evolution analysis of full gene of coronavirus

图4 BCoV HE蛋白基因序列遗传进化分析Fig.4 Genetic evolution analysis of BCoV HE protein gene sequence

图5 BCoV S蛋白基因序列遗传进化分析Fig.5 Genetic evolution analysis of BCoV S protein gene sequence

图6 BCoV M蛋白基因序列遗传进化分析Fig.6 Genetic evolution analysis of BCoV Mprotein gene sequence

图7 BCoV N蛋白基因序列遗传进化分析Fig.7 Genetic evolution analysis of BCoV N protein gene sequence

2.5 M基因组序列分析

M基因与日本的TCG-7、IWT-23毒株和美国US/OH3-TC/2006等较为接近，相似性均为99.42%。说明该毒株M基因与全基因组的变异相比更低。

2.6 N基因组序列分析

N基因组序列分析显示，该毒株与美国毒株US/OH3/2006、Giraffe US/OH3-TC/2006毒株100%相似，与中国SWUN/LN2/2018毒株和美国2018年毒株 4-17-08相似性均为99.85%，与日本毒株TCG-1相似性为99.55%，与TCG-7相似性为99.26%，该片段总体变异度较小。

3 讨论

国内外均进行了一些针对BCoV的病原学和血清学调查研究。国外研究结果显示，在美洲、欧洲、亚洲均有牛冠状病毒的发生，并且是引起小牛腹泻的重要病因，约20%～26%的小牛腹泻是由冠状病毒感染引起的[10-13]。国内牛冠状病毒调查报道涉及黄牛、奶牛、牦牛，其中牦牛核酸检出率高达69.05%，东北三省牛冠状病毒抗体阳性率达100%，山东牛群调查结果也显示BCoV 阳性率较高，新疆北部地区奶牛场119份犊牛粪便样品中检出BCoV核酸阳性样品12份，且检测到冠状病毒的犊牛均有显著的腹泻症状[14-18]。这些报道均来自北方寒冷地区或高海拔地区，国内南方温暖地区近年来未见报道。

经调查，本次检测到携带BCoV的黄牛是2019年4月初由缅甸勐拉地区的索累港入境中国，并在云南省景洪市勐龙镇一村庄短期育肥，采样时间是4月22日，距离进入国境已有10余天，其同圈牛并未检出核酸阳性样品，该牛是由缅甸带毒进入中国还是在中国本地感染的目前尚不清楚，需要持续加强对该区域的本地牛和入境牛的监测。牛可能来源地和病毒核酸检出地均为热带地区，常年日最高气温在30℃左右，本次检出BCoV虽然为个例，但至少说明该病毒已在东南亚热带亚热带地区存在。由于本实验室之前无该病毒的检测和分离，可以排除实验室核酸污染因素影响。

全基因组序列分析显示，本次检出的样品与美国毒株US/OH3/2006相似性达到99.33%，二者具有较高的同源性，但有基因变异。结构蛋白HE、S、M、N 与US/OH3/2006毒株的相似性分别为99.29%、99.36%、99.42%和100%，说明结构蛋白基因主要变异位点在HE基因，其次为S基因。由于结构蛋白E基因较短，仅约255个bp，经序列比对与本文关联毒株无差异，且对病毒的感染力影响意义不大，因此本文未做论述。