41 份木豆萌发期耐盐性综合评价

盛 伟，吴欣池，梁 浩，李慈云，马艳艳，张靖雪，丁西朋，李欣勇，刘国道

（1. 海南大学热带作物学院, 海南 海口 570228；2. 中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所, 海南 儋州 571737）

土壤盐渍化是一种非生物胁迫，极大地限制了作物的种子萌发、产量及品质，给农业生产造成了诸多不便[1]。我国盐碱化耕地面积已达到3.417 ×107hm2，筛选和种植耐盐作物是合理利用盐碱土的有效措施之一[2]。木豆(Cajanus cajan)为豆科牧草，用途广泛，可作粮食和饲料[3]，在药理活性[4]方面也具有极大潜力，在我国热带和亚热带地区普遍栽培[5]。因此，开展木豆耐盐种质资源的挖掘及耐盐机制研究，可为常规育种工作奠定基础，为急需改善的盐碱化耕地提供发展思路。

目前，关于木豆品种的筛选鉴定和耐盐机制的研究仍在起步阶段，李拴林等[6]发现在不同盐胁迫浓度下木豆种子的发芽率、发芽指数、胚根和胚芽，随盐浓度的增大而降低。Garg 和Sharma[7]发现盐胁迫可降低植物生物量、增加对根的负面效应。不同木豆种质资源在形态指标和物候期方面存在较大变异[8]。在对耐盐性关键指标的筛选中，已在扁蓿豆(Medicago ruthenica)[9]、偃麦草(Elytrigia repens)[10]、苜蓿(M. sativa)[11]、白三叶(Trifolium repens)[12]和白花草木樨(Melilotus alba)[13]中已经明确，但对不同基因型木豆种质耐盐性关键指标的筛选和耐盐性综合评价鲜见报道，严重影响了木豆在盐碱地的推广应用。

本研究以41 份木豆种质资源为材料，利用NaCl模拟盐胁迫，运用变异系数分析、相关性分析、主成分分析、隶属函数分析和聚类分析评价方法，确定木豆萌发期耐盐性评价指标，筛选萌发期耐盐种质，并探讨不同基因型木豆种质萌发期盐胁迫的生理耐受响应机制，旨在为木豆大规模耐盐性鉴定和耐盐机制研究，提供鉴定方法和理论基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试材料41 份木豆种质均由中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所种质资源库提供(表1)。

表1 41 份木豆种质资源基本信息Table 1 Basic information of the 41 pigeon pea varieties

1.2 试验方法

为确定参试木豆材料萌发期耐盐性评价的适宜胁迫浓度，提前从参试材料中随机选取6 份木豆种质材料，分别在NaCl 质量分数梯度为0 (CK)、0.15%、0.30%、0.60%、0.90%、1.20%、1.50% 时预试验。结果表明，NaCl 质量分数为0.90% 时，6 份木豆材料发芽率和幼苗生长受到明显抑制，且材料间差异显著，因此最终选择0.90% 的NaCl 溶液用以评价41份木豆材料萌发期的耐盐性。

选取大小均匀一致、饱满、无病虫害的种子，利用无水乙醇进行浸泡消毒(20 min)，随后用蒸馏水将种子清洗干净待用。采用纸上发芽法，对照组和处理组各设3 次重复，每重复50 粒，每培养皿铺2 层滤纸，分别施加10 mL 对应溶液。将种子均匀置于培养皿内，在人工气候箱进行恒温培养(25 ℃)，相对湿度为50%，第10 天发芽结束。

1.3 观测指标

1.3.1形态指标的测定

每隔24 h 观察记录发芽种子数，以胚根或胚芽突破种皮并长于种子长度为发芽标准，计算种子的发芽率(%)、发芽指数和活力指数。计算公式如下：

公式(2)中，Gt为第t日种子的发芽数，Dt为相应的发芽试验天数。

试验结束时，每处理随机选取10 株幼苗，用清水洗净，称量鲜重，随后利用LA-S 根系扫描软件(杭州万深检测科技有限公司)进行扫描分析，获得幼苗的根长(cm)、苗长(cm)、根长/苗长、根系表面积(cm2)、根系体积(cm3)、根系平均直径(mm)。

1.3.2 生理指标的测定

在萌发期耐盐性不同的各类别中，挑选代表性材料在幼苗第10 天时，进行取样。超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)活性采用NBT 光还原法测定[14]；过氧化物酶(peroxidase, POD)活性采用愈创木酚法测定[15]；过氧化氢酶(catalase, CAT)活性采用紫外吸收法测定[16]。

1.4 数据处理与分析

利用Excel 2007 进行数据录入和作图表，SPSS 23软件进行数据分析。使用变异系数分析、相关性分析和因子主成分分析，对木豆萌发期耐盐性评价指标进行筛选；根据隶属函数分析和聚类分析，对41 份木豆材料萌发期耐盐性综合评价。同时，为减少各材料间指标性状固有性差异，各指标值均使用相对值来进行分析。

公式(5)为正向隶属函数公式，公式(6)为反向隶属函数公式，式中：R(Xi) 为各指标隶属函数值，Xi为指标测定值，Xmin、Xmax为所有参试材料某一指标的最小值和最大值；Wj为第j个综合指标在所有综合指标中的重要程度及权重大小；Pj表示各品种第j个综合指标的贡献率；D值表示在盐胁迫下各品种耐盐能力的综合评价值。

2 结果与分析

2.1 盐胁迫对木豆种子萌发与幼苗生长的影响

如表2 所列，盐胁迫下，木豆种子萌发期10 项观测指标的变异系数在0.178～0.790，说明41 份木豆材料的各指标性状之间存在差异。其中，相对根系表面积、相对根系体积、相对根长、相对苗长、相对根冠比的变异系数均在0.500 以上，分别为0.790、0.645、0.621、0.551 和0.580，说明这5 项指标在盐胁迫后的变化更大。相对根系平均直径、相对发芽率、相对发芽指数、相对活力指数和相对鲜重的变异系数均未超过0.300，分别为0.253、0.178、0.202、0.293和0.293，说明这5 项指标受盐胁迫的影响较小。

表2 盐胁迫下41 份木豆材料的10 项相对指标Table 2 Variation in 10 physiological response indices for 41 pigeon pea varieties under salt stress

2.2 盐胁迫下木豆种子萌发期指标的相关性

如表3 所列，相对根系表面积与相对根系平均直径极显著负相关(P＜ 0.01)，与相对根系体积、相对根长极显著正相关；相对根系平均直径与相对根长显著负相关(P＜ 0.05)；相对根系体积与相对活力指数、相对鲜重、相对根冠比显著正相关，与相对根长极显著正相关；相对发芽率与相对发芽指数、相对活力指数极显著正相关；相对发芽指数与相对活力指数显著正相关，与相对鲜重显著负相关；相对活力指数与相对根长、相对苗长显著正相关，与相对鲜重极显著正相关；相对根长与相对苗长显著正相关，与相对鲜重和相对根冠比则极显著正相关；相对苗长与相对鲜重极显著正相关，与相对根冠比极显著负相关。这说明10 项观测指标间密切程度高，进一步通过主成分分析来确定木豆萌发期耐盐性评价指标。

表3 盐胁迫下41 份木豆材料各指标间相关系数Table 3 Pearson’s correlation coefficients of 10 physiological response indices for 41 pigeon pea varieties under salt stress

2.3 耐盐性评价指标筛选

主成分分析(表4) 表明，前4 个主成分的累加贡献率达80.14%，特征值都大于1，因此将前4 个成分作为41 份木豆材料耐盐性评价的主要因子。第1 主成分对应特征向量中载荷排名前3 的指标是相对根长、相对根系体积和相对根系表面积，分别为0.790、0.738 和0.718；第2 主成分对应特征向量载荷排名前3 的指标是相对根冠比、相对苗长和相对鲜重，分别为-0.811、0.736 和0.512；第3 主成分对应特征向量载荷排名前3 的指标是相对发芽指数、相对发芽率和相对活力指数，分别为0.903、0.770和0.392；第4 主成分对应特征向量载荷排名前3 的指标是相对根系平均直径、相对根系体积和相对苗长，分别为0.795、0.365 和-0.322。综合相关性分析和主成分分析结果，选择4 个主成分中与其他指标存在极显著相关性且特征向量绝对值最大的指标(相对根长、相对根冠比、相对发芽指数和相对根系平均直径)作为木豆种子萌发期耐盐评价指标。

表4 4 个主成分的贡献率及载荷矩阵Table 4 Principal component analysis coefficients and cumulative contributions of the 10 physiological response indices used for 41 pigeon pea varieties under salt stress

2.4 41 份木豆耐盐性综合评价

综合隶属函数值结果(表5)表明，41 份木豆材料种子萌发期耐盐能力存在明显差异，排在前3 位的耐盐综合隶属函数值分别为0.620、0.558 和0.527，都在0.5 以上，表明这3 份材料耐盐性较强；排在最后3 位的隶属函数值都在0.3 以下，分别为0.292、0.289 和0.259，表明耐盐性较弱。

表5 41 份木豆材料耐盐隶属函数值Table 5 Subordinate function value analysis of 41 pigeon pea varieties under salt stress

聚类分析(图1) 结果表明，在欧式距离5 处可将41 份木豆材料划分为4 个类群：第1 类群为高耐盐型种质，含有1 份种质，约占总材料的2.44%；第2 类群为耐盐型种质，含有10 份种质，占总材料的24.39%；第3 类群为中间型种质，含有23 份种质，占总材料的56.10%；第4 类群为盐敏感型种质，含有7 份种质，占总材料的17.07%。

图1 41 份木豆材料耐盐性聚类分析图Figure 1 Cluster analysis plot of 41 pigeon pea varieties under salt stress

2.5 不同耐盐性木豆在盐胁迫下的生理响应分析

从耐盐性结果得到的4 种不同耐盐性类群中，分别选择代表性材料(高耐盐型“34”、耐盐型“3”和“9”、中间型“37”和“8”、盐敏感型“35”和“22”)进行生理指标测定分析。结果表明，0.9%盐胁迫处理下不同耐盐性木豆的SOD 活性均不同程度下降(除盐敏感型“35”外)，其中，耐盐型“9”、中间型“8”和盐敏感型“22”显著低于对照(P＜ 0.05)，高耐盐型木豆的SOD 活性高于盐敏感型(图2)，表明高耐盐型木豆较盐敏感型清除活性氧的能力更强，对细胞膜系统损害的抵抗力更强。0.9% 盐胁迫处理下的高耐盐型、中间型和盐敏感型木豆的POD 活性均显著高于对照(P＜ 0.05)，分别为对照的3.80 倍、1.91 倍、2.05 倍、4.36 倍、2.91 倍和4.57 倍，高耐盐型木豆的POD 活性高于耐盐型、中间型和盐敏感型；中间型和盐敏感型木豆在盐胁迫处理下，其POD 活性呈上升趋势，表明植株对盐敏感的程度越高，对细胞损伤程度越高。在0.9% 盐胁迫处理下，CAT 活性与对照相比变化较小，仅高耐盐型“34”和耐盐型“3”显著高于对照(P＜ 0.05)，但高耐盐型、耐盐型同盐敏感型的CAT 变化趋势有所不同；高耐盐型“34”和耐盐型木豆“3”和“9”的CAT 分别较对照提升了37.02%、97.31% 和11.58%，盐敏感型木豆“35”和“22”的CAT 较对照降低了34.31%和11.67%。

图2 不同耐盐性木豆在盐胁迫下的超氧化物歧化、过氧化物酶和过氧化氢酶活性Figure 2 Superoxide dismutase (SOD), peroxisome (POD), and catalase (CAT) activities of the different salt-tolerant pigeon pea varieties under salt stress

3 讨论

3.1 木豆种子萌发期耐盐性评价

本研究发现，在0.9%盐胁迫下，41 份木豆种子萌发期耐盐性具有明显差异，可分为高耐盐型(2.44%)、耐盐型(24.39%)、中间型(56.10%) 和盐敏感型(17.07%)。通常情况下，盐胁迫可显著降低植物种子发芽率[9-10,12,17]。然而，本研究发现，0.9%盐胁迫对木豆种子的发芽抑制不显著，这可能是由于木豆种子发芽速率快，导致盐胁迫对其影响不显著，但是盐胁迫可显著抑制木豆幼苗的生长。这一研究结果与低盐浓度胁迫能促进草木樨[18]、沙打旺(Astragalus adsurgens)[19]种子发芽相似。作物的耐盐性，在不同的生长发育阶段存在差异，木豆在萌发期表现出较好的耐盐性种质，在苗期是否具有相同的特性有待进一步研究。

3.2 木豆种子萌发期耐盐性指标筛选

作物种质资源对环境的可塑性是培育品种的基础[20]，在逆境条件下表现出稳定性和优异性的特点，是培育优良品种的关键[21]。在作物的萌发期进行耐盐性鉴定，具有周期性短、效率性高和可操作性强的特点，是鉴定作物出苗率和成苗率的关键时期[22]。作物材料间具有差异，一般发芽率、发芽势、根长、苗长作为作物萌发期耐盐鉴定的重要指标[23]。

已有研究表明，发芽指数和活力指数可作为紫花苜蓿(Medicago sativa)种质资源萌发期耐盐性评价指标[24]。此外，地上部鲜重、根鲜重、根干重、根长、根体积和根分枝数可作为绿豆(Vigna radiata)苗期耐盐性评价指标[25]；同时，叶面积、叶绿素荧光、根冠比和SPAD 可作为苜蓿苗期耐盐性鉴定指标[26]。本研究结果表明，相对根长、相对根冠比、相对发芽指数和相对根系平均直径可作为41 份木豆材料耐盐性评价指标。通过隶属函数分析和聚类分析得到41 份木豆材料的耐盐性排序。目前该方法已在大豆(Glycine max)[27]、水稻(Oryza sativa)[28]等作物中应用。

本研究表明，盐胁迫对木豆种子萌发的影响主要在表观形态方面，体现在幼苗地上部与地下部的生长差异，未来可进一步对木豆苗期进行耐盐性评价，和耐盐性评价指标的筛选。

3.3 木豆幼苗耐盐性生理响应评价

抗氧化酶系统是植物体内重要的酶促防御系统，可有效清除植物在非生物胁迫下，积累过多的活性氧和维持氧化还原系统动态平衡[29]。SOD 主要通过降低氧自由基，清除活性氧，达到缓解细胞膜系统损害[30]。POD 和 CAT 则是降低细胞内过氧化氢的积累，从而保护细胞膜的完整性，提高逆境耐受能力[31]。本研究结果表明，在盐胁迫处理下，随着木豆种子对盐敏感的增加，SOD 活性呈下降趋势，POD 活性则呈上升趋势；CAT 活性与对照相比变化较小，但高耐盐型、耐盐型同盐敏感型的变化趋势有所不同，较对照呈下降趋势。总的来说，高耐盐型和耐盐型木豆幼苗在盐胁迫下生理响应中，能够及时促发体内酶促防御系统，而中间型和盐敏感型木豆更能受到盐离子的侵害。这一研究结果与盐胁迫下耐盐型谷子(Setaria italica)[32]和燕麦(Avena sativa)[33]较盐敏感型种质生理耐受性更强一致。

4 结论

对41 份木豆种质资源萌发期耐盐性评价，根据耐盐性的强弱可分为高耐盐型、耐盐型、中间型和盐敏感型4 种不同类型。其中，相对根长、相对根冠比、相对发芽指数和相对根系平均直径可作为后期木豆种质筛选主要评价指标。本研究为木豆耐盐种质评价和耐盐育种提供理论依据。