抗纤软肝颗粒含药血清对肝卵圆细胞系WB-F344上皮间质转化的影响*

唐温谦 刘金鑫 薛 娟 罗 磊 王 瑶 杨 帆,6△

一直以来，肝癌因其超高的全球发病率和病死率威胁着人类的健康，肝癌的发生通常会经过一段漫长的肝癌前病变时期[1, 2]，肝癌前病变的实质是肝细胞异常增殖、分化及凋亡紊乱[3]，是肝纤维化、肝硬化进展为肝癌的重要阶段[4]。

抗纤软肝颗粒是湖北省中医院的院内制剂，具有扶正化瘀、软坚散结的功效。从20世纪90年代开始，一直被临床上用于治疗肝纤维化以及肝硬化患者，具有很好的疗效。之前的研究也证实抗纤软肝颗粒具有保护肝脏，缓解肝纤维化，改善肝脏微环境的作用[5, 6]。

为进一步了解抗纤软肝颗粒对肝癌前病变的阻断作用和机制，为肝癌的早期防治提供新的思路和方法，笔者观察了抗纤软肝颗粒含药血清对N-甲基-N-硝基-N-亚硝基胍(MNNG)诱导肝卵圆细胞系WB-F344上皮间质转化(EMT)过程中相关蛋白及细胞上清中甲胎蛋白(AFP)变化的影响。

1 材料与方法

1.1 材料肝卵圆细胞系WB-F344购自武汉大学细胞典藏中心。抗纤软肝颗粒制剂购自湖北省中医院，SD雄性大鼠(购自华中科技大学实验动物中心，许可证号：420098000027320)。DMEM高糖培养基、胎牛血清(FBS)(购自美国GIBCO)，N-甲基-N-硝基-N-亚硝基胍[(Nmethyl-N’-nitro-N-nitrosoguanidine,MNNG)购自中国北京百灵威科技有限公司(J&K Scientific)]。一抗(E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、GAPDH)、山羊抗兔二抗(购自武汉Proteintech Group)。甲胎蛋白(AFP)Elisa试剂盒[购自Elabscience(E-EL-R0153c)]。CCK-8试剂盒购自美国GLPBIO。

1.2 含药血清的制备健康清洁级SD大鼠20只，体质量(200±20)g,随机分为2组。抗纤软肝颗粒配制成4.06 g/ml药液，实验组按成人10倍剂量(即1 ml/100 g体质量)给SD大鼠连续6 d灌胃,每天给药2次,第6天当夜禁食禁水, 第7天再给药1次(1 d的量)。对照组予以相同剂量生理盐水灌胃。给药1 h后, 用2%戊巴比妥钠溶液腹腔麻醉, 无菌条件下腹主动脉取血, 立即注入无菌EP管中, 室温静置0.5～1 h, 3000 rpm离心10 min, 吸取上清,-80 ℃保存备用。

1.3 细胞造模及分组方法取冻存于液态氮中的WB-F344细胞株, 复苏后用含10%胎牛血清(FBS)、100 U/L-1青霉素和100 mg/L-1链霉素的DMEM培养基置于培养箱内于37 ℃、5%CO2条件下培养。取处于对数生长期细胞用0.25%胰蛋白酶消化后，用完全培养基制成细胞悬液，按2×104个/ml接种于6孔板，每孔2 ml。随机分为正常组、模型组、抗纤软肝颗粒含药血清高、中、低组，除正常组外，余各组用3 mg/L的MNNG刺激24 h, 之后采用浓度为7×10-7mol/L的H2O2持续刺激12 h诱导EMT形成[7, 8]。弃上清，PBS漂洗，正常组、模型组予以等量空白血清，余各组分别予以高(原含药血清浓度)、中(原含药血清浓度一半)、低(原含药血清浓度四分之一)不同浓度的抗纤软肝颗粒药物血清刺激细胞48 h。

1.4 CCK8法检测细胞的增殖能力取对数生长期的细胞悬液, 接种于96孔板, 分组给药刺激, 将加了相应量细胞培养液和CCK-8溶液但没有加入细胞的孔作为空白组, 每组6个复孔, 培养24 h后每孔加入10 μl增强型CCK-8溶液。在细胞培养箱内继续孵育1 h, 用酶标仪检测450 nm吸光度, 并计算细胞活力。

1.5 Western blot 检测蛋白的表达用 RIPA裂解液进行细胞裂解提取蛋白质，Bicinchonininc acid(BCA)法检测蛋白浓度。经100 g/L SDS—PAGE分离胶电泳，聚偏二氟乙烯(PVDF)膜转膜，50 L脱脂奶粉封闭，免疫反应抗体孵育一抗(E-cadherin, N-cadherin, Vimentin及GAPDH均按1∶1000)，4 ℃过夜。TBST洗涤3次，加入封闭液稀释的二抗(1∶3000)后，常温下孵育1.5 h，TBST洗涤3次，二氨基联苯胺(DAB)显示液浸泡曝光，暗室发光、显影、定影并获取图像。

1.6 酶联免疫吸附实验(ELISA)检测细胞上清中甲胎蛋白(AFP)含量在酶标包被板上分别设空白孔、标准孔、待测样品孔。空白孔加样品稀释液100 μl，余孔分别加标准品或待测样品100 μl。给酶标板覆膜，37 ℃孵育90 min；弃去液体，甩干，每个孔中加入生物素抗体工作液100 μl，酶标板加上覆膜，37 ℃温育1 h；弃去液体，甩干，每孔加酶结合物工作液100 μl，加上覆膜，37 ℃温育3 min；弃去孔内液体，甩干，洗板5次，每孔加底物溶液90 μl，酶标板加上覆膜37 ℃避光孵育15 min；每孔加终止液50 μl，终止反应，此时蓝色立转黄色；5 min内用酶标仪在450 nm波长测量各孔的光密度(OD值)

2 实验结果

2.1 抗纤软肝颗粒含药血清对MNNG诱导肝卵圆细胞系WB-F344增殖能力的影响与正常组比较，模型组细胞OD值高于正常组(P<0.05)，表明MNNG可以促进肝卵圆细胞系WB-F344的恶性增殖，造模成功；与模型组比较，含药血清组细胞OD值低于模型组胞OD值越低(P<0.05)，表明抗纤软肝颗，且含药血清浓度越高，细粒含药血清可以抑制肝卵圆细胞系WB-F344的恶性增殖。见表1。

表1 各组细胞OD值

2.2 抗纤软肝颗粒含药血清对MNNG诱导WB-F344细胞上清中AFP水平的影响与正常组比较，模型组细胞上清中AFP含量高于正常组(P<0.05)；与模型组比较，含药血清组细胞上清中AFP含量低于模型组，且含药血清浓度越高，AFP含量越低(P<0.05)，表明KXRG可以抑制MNNG诱导WB-F344细胞中AFP的生成，且抑制作用与其浓度成正相关。见表2。

表2 各组细胞上清中AFP的含量

2.3 抗纤软肝颗粒含药血清对MNNG诱导WB-F344细胞中EMT相关蛋白的影响与正常组比较，模型组细胞中E-cadherin蛋白表达均低于模型组(P<0.05)，而N-cadherin, Vimentin蛋白在细胞中的表达均高于模型组(P<0.05)；与模型组比较，含药血清组细胞中E-cadherin蛋白表达均高于模型组，且含药血清浓度越高，蛋白表达越高(P<0.05)，相反细胞中N-cadherin, Vimentin蛋白表达均低于模型组，且含药血清浓度越高，蛋白表达越低(P<0.05)。表明KXRG可以抑制MNNG诱导WB-F344细胞中EMT的改变，且具有浓度依赖性。见表3。

表3 各组细胞EMT相关蛋白的表达

3 讨论

肝癌的发生是一个多阶段的发展过程[9]。研究显示，在中国，90%以上的肝癌是由肝炎导致的肝纤维化和肝硬化更进一步发展，成为肝癌[10]。肝癌前病变是肝癌进展中启动、促进和演变过程的中间阶段[11]，其主要病理特征为HOC的增生，不良的微环境促使HOC的上皮间质转化(EMT)的平衡打破，增加其对致癌物的易感性，加速了HOC的恶性转变[12]。

研究表明，EMT的发生在肝癌前病变中起着重要作用[13]，EMT是指在一定条件下，上皮细胞在形态学上发生向间质细胞表型的改变[14]，当细胞发生EMT时，不仅有细胞表型的改变，还包括细胞标志蛋白的改变，其特点是上皮细胞标志蛋白(E-cadherin)的减少和间质细胞标志蛋白(N-cadherin和Vimentin)的增加[15]。E-cadherin是维持上皮细胞特性的一个重要分子,N-cadherin很少表达于正常上皮细胞中, 当细胞发生EMT时，N-cadherin表达上调，细胞间黏附性降低，从而允许细胞发生迁移或转移，E-钙黏蛋白向N-钙黏蛋白的转化, 被称为钙黏蛋白的转换, 是肝癌前病变中EMT的关键步骤[16]。Vimentin是蛋白中间纤维家族重要成员, 广泛表达于正常细胞间质, 其生物学功能包括维持细胞及细胞器形态、参与细胞分裂与分化、促进细胞黏附及移行、信号传导等[17-19]。甲胎蛋白(AFP)是肝卵圆细胞的标志物，当肝卵圆细胞过度增殖，向肝癌细胞转换时，AFP的表达升高[20]。研究证实，AFP作为肝癌干细胞的标志之一，可预示着患者的生存状态和肿瘤复发[21]。因此，将AFP作为肝卵圆细胞已经转换为肝癌细胞的动态观察指标。

中医认为，肝纤维化属于“癥瘕”“积聚”“臌胀”等范畴。2019年《肝纤维化中西医结合诊疗指南(2019年版)》[22]提出正虚邪盛，邪毒久稽，肝络受损，气滞血瘀是肝纤维化-肝癌过程中基本病机，可归纳为“虚损生积”。抗纤软肝颗粒作为“软坚散结，扶正化瘀”法的代表方，是已故国家级名老中医吕继端先生治疗肝纤维化和肝硬化的经验方，具有软坚散结、扶正化瘀的功效，之前的研究表明KXRG可以通过抑制肝星状细胞(HSC)活化，从而抑制肝纤维化的发展[5, 6]。而HSC的活化也贯穿肝细胞癌癌前病变全过程[23]。一方面大量活化的HSC降低间质胶原酶活性，减少细胞外基质蛋白降解，使大量胞外基质蛋白沉积，从而调节胞外基质的降解与合成；另一方面HSC分泌的促炎因子又进一步加重对已损伤肝细胞区域的浸润，促进局部炎性细胞的趋化性、黏附性和活性，进而促使肝癌微环境的形成[24]。基于此，笔者提出KXRG能够通过抗肝纤维化改善肝癌微环境，有利于肝卵原细胞向正常肝细胞的方向分化，抑制肝卵原细胞异常增殖，诱导其凋亡，从而延缓或阻断肝癌癌前病变的发生发展。

本研究显示KXRG可以抑制肝癌前病变过程中肝卵圆细胞的增值，抑制肝卵圆细胞上皮-间质的转化，从而抑制肝癌的发生和发展，其可能的机制是调控EMT过程中相关蛋白E-cadherin、Vimentin和N-cadherin的表达。

这些发现为运用“软坚散结，扶正化瘀”法在肝纤维、肝硬化阶段进行早期干预，防治肝癌提供了基础研究依据。然而，由于抗纤软肝颗粒含药血清成分的复杂性，无法确定单体成分的作用性及其作用机制，这也会是今后更进一步研究的重点。