大兴安岭凋落物中可培养真菌分离、鉴定及活性筛选

司 璐，吴 彤，甄锦程，于洪佳，刘 瑶，杨 骁，徐利剑

（黑龙江大学现代农业与生态环境学院，哈尔滨 150080）

0 引言

真菌是世界上分布最广泛的物种之一，也是生态环境中重要的分解者，森林凋落物中有大量真菌存在。真菌资源已经被广泛应用于农业、工业和医药等与人类生活息息相关的多个重要领域[1-3]。真菌物种多样性丰富，能够产生活性多样、结构新颖的次生代谢产物，是天然产物的重要来源[4]。目前已从真菌的代谢产物中提取出多种具有抗菌、抗病毒、抗氧化、抗肿瘤等功能的活性物质[5-9]。

森林中大量的林下凋落物，需要微生物降解利用，凋落物真菌在其中发挥着重要的作用[10]。大兴安岭森林处于高纬度寒区，是中国森林面积最大的森林之一，其中包含许多未被利用的真菌资源[11-15]。例如，刘博洋等[12]在大兴安岭森林凋落物中发现的未开发真菌中，2株表现出抗细菌活性，2株表现出抗氧化活性。张哲栋等[13]在18株未被开发真菌中，发现5株真菌对青枯劳尔氏菌有抗菌活性。邱天艺等[14]在21株未被开发真菌中，发现有17株真菌表现出了抗菌活性。孟建宇等[15]分离得到2株具有高纤维素酶活的常温纤维素降解菌。近年来，在真菌中发现了许多新的生物碱类、聚酮类、萜类、苯丙素类、甾体类等次生代谢产物，在抗菌、抗虫、抗氧化、抗癌等方面发挥着重要作用[16-19]。大兴安岭森林凋落物中真菌资源丰富，有望发现未被开发利用的真菌，为真菌次生代谢产物研究提供备选菌株。

本研究以大兴安岭凋落物为材料，从中分离出可培养真菌并对其进行鉴定，对它们次生代谢物进行抗菌、抗氧化活性测试，为进一步开发利用大兴安岭真菌资源提供备选菌株。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 样品采集 凋落物样品于2019年9月采自大兴安岭地区。该地区主要的植物为兴安落叶松(Larix gmelinii)，白桦(Betula platyphylla)与蒙古栎(Quercus mongolica)等。凋落物样品的采集以每层约10 cm的深度共采集三层。将采集好的样品分别装在灭菌的信封里，自然风干保存。

1.1.2 供试培养基 马铃薯葡萄糖培养基(PDA)用于真菌纯化及形态学观察，每升配方如下：葡萄糖20 g、马铃薯200 g、琼脂20 g。1/4马铃薯葡萄糖培养基(1/4 PDA)用于真菌分离：马铃薯50 g、葡萄糖5 g、琼脂20 g。

以下培养基用于发酵。马铃薯葡萄糖液体培养基(PD)：马铃薯200 g、葡萄糖20 g。马铃薯葡萄糖加烟酰胺培养基(PD+Nic)：烟酰胺浓度为100 μg/mL的PD培养基。大米培养基(Rice)：甘油2 g，酵母浸粉2 g，酒石酸钠10 g，磷酸二氢钾1 g，七水硫酸镁1 g，七水硫酸亚铁0.05 g溶解于1 L水中，获得配方溶液；50 mL三角瓶中需称取8.4 g大米和14 mL配方溶液。酵母提取物蔗糖培养基(YES)：酵母浸粉20 g、蔗糖100 g、硫酸镁1 g、加入适量蛭石。超级麦芽培养基(SM)：麦芽浸粉50 g、酵母浸粉10 g、七水硫酸亚铁20 mg、七水硫酸锌7 mg。

细菌基础培养基(LBA)用于抗细菌活性测定：胰蛋白胨10 g、酵母浸粉5 g、氯化钠10 g、琼脂20 g。PDA用于抗真菌活性测定。

1.1.3 供试微生物 丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae)，青枯劳尔氏菌(Ralstonia solanacearum)，立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)和大斑病凸脐蠕孢菌(Exserohilum turcicum)用于抗菌活性测试。

1.2 试验方法

1.2.1 真菌的分离 采用颗粒涂布平板法[20]进行真菌分离。首先将凋落物研磨至颗粒状，然后将凋落物颗粒悬浮液涂布于1/4 PDA平板上，放置于恒温培养箱中培养，每12 h观察一次，在体式显微镜下，挑出萌发的真菌至60 mm的PDA培养基上，进行纯化培养。

1.2.2 真菌的鉴定 利用CTAB法[21]提取分离得到的真菌总DNA，然后用引物ITS1和ITS4[22]扩增其内部转录间隔区(Internal Transcribed Spacer，ITS)，其中PCR扩增的体系和条件参见Liang等[20]的方法。PCR产物经测序后，得到的序列与NCBI网站(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/)提供的BLAST(Basic Local Alignment Search Tool)进行序列分析，初步确定该凋落物真菌的分类学地位。对活性较好的菌株与其相关的序列进行系统发生学分析，利用MEGA 7测试出其最优模型后，利用最大似然法(Maximum Likelihood，ML)构建系统发育树。形态学观察方面，观察在不同培养基上的菌落特征，例如菌落颜色、质地和分泌物等特征；观察产孢结构和孢子的形状、大小等特征。

1.2.3 菌株的发酵及其粗提物的制备 将菌块接种于PD培养基中，在180 r/min，25℃条件下振荡培养3～4天，然后吸取200µL上述菌液，分别接种到20 mL体系的PD、PD+Nic、YES、SM、Rice以及PDA中进行发酵。固体发酵21天，液体发酵在180 r/min，25℃条件下培养14天。将发酵完成后的培养基中放入等量的乙酸乙酯，静置24 h，获得有机相，将其进行浓缩后称重，加入1 mL的10%的二甲基亚砜(Dimethyl sulfoxide，DMSO)，配置成真菌提取液。

1.2.4 抗菌活性测定 采用打孔药剂扩散法[23]进行抗菌活性的筛选。抗细菌：取10 mL测试细菌液加入到温度在50℃的LBA中倒平板，用无菌打孔器均匀的打7个孔。孔中加入10 μL真菌提取液或100 mg/L金霉素（阳性对照），培养24 h后测量抑菌圈。抗真菌：将丝状真菌接种至PDA的正中央，在其周围均匀地打7个孔，孔中加入10 μL真菌提取液或100 mg/L两性霉素b（阳性对照），将其放入培养箱中培养3～5天后，测量抑菌圈。

1.2.5 抗氧化活性测定 采用TLC-DPPH法[24]进行抗氧化活性的筛选。称取0.2 g的1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)，溶解在100 mL的甲醇中。将粗提物配制成5 mg/mL的甲醇溶液。用毛细管吸取等量的样品，点样后喷洒DPPH溶液，观察褪色圈。将活性较好菌株的粗提物进行进一步分析。用毛细管取等量的样品点样于层析板下部，利用甲醇二氯甲烷1:10的展开剂展开，然后喷洒DPPH溶液，计算活性组分的迁移率(Rf)值。

2 结果分析

2.1 菌株鉴定分离结果

从大兴安岭凋落物中共分离得到65株真菌，通过ITS序列与已鉴定的真菌进行比对分析的结果详见表1。这65株真菌隶属于2个门，6个纲，28个科，47个属54个分类单元，去除重复分离得到的菌种，其中有16株真菌ITS的相似性≤98%。

表1 疑似新种的ITS序列相似性分析

2.2 抗菌活性测定结果

对这16株相似性≤98%的菌株的乙酸乙酯粗提物进行抗菌活性测定。其中有8株真菌的粗提物具有抗细菌的活性见表2，其中SL723和SL098的对青桔劳尔氏菌的活性较好，只有SL098有抗丁香假单胞菌的活性。

表2 真菌提取物的抗细菌活性

有10株真菌的粗提物有抗病原真菌的活性，测定结果详见表3。其中有7株菌有抗立枯丝核菌的活性，有6株菌的粗提物有抗大斑病凸脐蠕孢菌的活性。其中SL098、SL503、SL710和SL723这4株菌的粗提物对这2种病原真菌都有活性。

表3 真菌提取物的抗真菌活性

2.3 抗氧化活性测定结果

通过TLC-DPPH法进行了抗氧化活性测定（图1a）。其中具有抗氧化活性的菌株共有6株，SL098、SL503和SL723的抗氧化活性较强，详细结果详见表4。

表4 真菌提取物的抗氧化活性

将SL098的YES和大米培养基粗提物（图1b），SL503的PD和PDA粗提物（图1c），SL723的PD和大米培养基粗提物（图1d）进行了TLC分析。SL098的YES和大米培养基粗提物中有两条明亮的带，Rf值分别为0.73与0.80。SL503的PD和PDA粗提物有两条明亮的带，Rf值分别为0.71与0.78。SL723的PD和Rice粗提物有一条带，Rf值为0.84。对于这3株菌来说，相同菌株不同培养基的抗氧化化合物的数量与种类基本一致，但不同菌株可以产生不同的抗氧化化合物。

2.4 活性菌株的鉴定

菌株SL098在PDA上培养14天后的生长直径为46 mm（图2a）；菌落正面中间浅棕色，边缘灰绿色，菌落背面中间红棕色，边缘灰绿色；气生菌丝短绒毛状，菌落的表面有橙色分泌物。菌株SL503在PDA上培养14天后的生长直径为13 mm（图2b）；菌落的正面为白色，背面为乳白色；气生菌丝不发达，绒毛状，表面湿润。菌株SL723在PDA上培养14天后的生长直径为14 mm（图2c）；菌落正面白色，有放射状沟纹，边缘红棕色、啮蚀状，背面红棕色；气生菌丝短绒毛状。将这3株菌与其相关菌属进行ITS序列的系统发育分析（图3），SL098、SL503和 SL723这 3株菌分别与Phaeosphaeria、Cephalosporium和Ophiobolus这3个属最为相近，见图3。

图2 3株菌的菌落图片（a为SL098，b为SL503，c为SL723）

图3 3株菌的系统发育分析

3 讨论与结论

本研究从大兴安岭森林凋落物中分离得到65株真菌，共有47个属54个分类单元，其中有16株真菌的相似性≤98%，其中8株真菌有抗细菌活性，10株真菌有抗真菌活性，6株真菌同时具有抗细菌、抗真菌的活性。有6株真菌的粗提物有抗氧化活性。其中SL098、SL503、SL723这3株菌的粗提物对抗真菌、抗细菌和抗氧化方面都表现出来良好的活性。李泽宇[25]等曾在冻土中发现2株凋落物真菌同时具有抗真菌、细菌与抗氧化活性，本研究发现的这3株菌与其分类学地位不同。刘博洋等[12]在凋落物中分离得到2株抗菌活性较好的菌株，最相近菌属为Pyrenochaetopsis microspora和Helicoma monilipes和这3株菌隶属于不同的科，有明显的差异。分离2株抗氧化活性较好的菌株为LB0012和LB0022，分别隶属于Helotiaceae和Phaeosphaeriaceae这2个科，其中LB0022和SL098、SL723为同一个科的不同属。

SL098最相近菌为Phaeosphaeria属真菌，该属的P.nodorum、P.spartinae、P.rousseliana和P.avenaria等菌曾被报道过具有抗稻瘟病(Pyricularia oryzae)，水稻纹枯病，小麦锈病(Puccinia recondita)，黄瓜灰霉病(Botrytis cinerea)和马铃薯晚疫病(Phytophthora infestans)的活性，对金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)等阳性细菌有较好的活性，分离过聚酮类、异香豆素、苝醌类、萜类等10多种抗菌活性的化合物[26]；本研究首次发现该属真菌还具有抗大斑病凸脐蠕孢菌及抗革兰氏阴性菌（丁香假单胞与青枯劳尔氏菌）的活性。SL503最相近菌为头孢菌(Cephalosporium)属真菌，该属真菌曾被报道过具有抗氧化活性及抗菌活性，可以产生头孢菌素等抗菌化合物[27-29]，不排除SL503也可以产生同类抗菌化合物，但SL503与其最相近菌株的ITS相似性为92.03%，可能为新物种。SL723最相近菌属为Ophiobolus属，该属的O.vermisporis曾被报道过对拟杆菌属(Bacteroides)细菌有较好的活性，该属的其他菌也曾报道过对胡麻叶斑病(Cochliobolus miyabeanus)的抗菌活性，分离得到过Vermisporin和Ophiobolide等抗菌化合物[30-31]，未曾报道过抗氧化活性。

综上所述，大兴安岭凋落物真菌中还存在着多种抗菌与抗氧化资源，本研究发现了3株凋落物真菌同时具有抗菌及抗氧化活性，为凋落物真菌资源的进一步开发利用提供了参考与备选菌株。