数据挖掘分析polo样激酶家族在乳腺癌mRNA中的表达与预后的关系

仇骞慧，仇伊尔，陆国文，邬颖杰

乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一，损害妇女的身体健康和心理健康，且近年来其发病呈年轻化趋势[1]。尽管肿瘤的诊治技术水平发展迅速，但乳腺癌，特别是三阴性乳腺癌的治疗仍是一个难题。目前备受医患关注的靶向治疗具有选择性高、对正常组织无损害等优点，已成为众多肿瘤治疗方式中的首选，但靶向治疗的发展需要进一步探究肿瘤分子机制。

Polo样激酶家族（PLKs）包括PLK1、PLK2、PLK3、PLK4及PLK5，它们在正常细胞和癌细胞的DNA复制和有丝分裂中都起着重要的作用[2-3]。PLK1是该家族中被研究最深入的成员，在许多癌症中出现异常表达，包括乳腺癌、鼻咽癌、胶质母细胞瘤、非霍奇金淋巴瘤、白血病、黑色素瘤、生殖系统肿瘤和消化道肿瘤等[4]。研究表明，PLK1过表达可能加速了TP53（一种肿瘤抑制因子）的破坏而导致癌细胞增殖和转移。在人类癌症患者中，50%以上TP53被破坏[3]。PLK2（也称为SNK）可能是一种肿瘤抑制因子，据报道，PLK2在血液系统恶性肿瘤中的表达显著降低[5]。PLK3在GO和细胞周期晚期表达[6]，有PLK3缺陷的小鼠被发现多个器官自发地形成了肿瘤[7]。PLK4是着丝粒调控蛋白，可增加非整倍体的风险，抑制PLK4的表达可提高癌症治疗敏感性[8]。目前对于PLK5的研究很少，有研究指出，PLK5在人脑肿瘤中表达下调[9]。本研究通过数据挖掘分析不同Polo样激酶家族（PLKs）在人乳腺癌mRNA中的表达水平及与预后的关系，现报道如下。

1 临床资料

1.1 数据库检索

1.1.1 Oncomine数据库 使用该数据库在对应栏中输入基因名称、肿瘤类型、mRNA水平和样本类型值0.01（可更改），表达差异（fold change，可自定），基因排名（Ranking 10%，可自定）等，研究PLKs在不同肿瘤中的差异表达，制成差异全景图。

1.1.2 GEPIA2数据库 在数据库的对应框中输入研究基因名称，选择要分析的肿瘤（如BRCA）。本研究利用该数据库分析了乳腺癌组织和正常乳腺组织中PLKs的表达情况。

1.1.3 UALCAN数据库 在UALCAN数据库输入研究的基因，再在TCGA数据库样本中选择研究肿瘤来分析有关预后的各种因素。本研究利用UALCAN数据库分析了不同PLKs的表达水平与癌症分期、分类和个体年龄之间的关系。

1.1.4 Kaplan-Meier plotter绘图仪 通过绘图仪分析了乳腺癌患者的无复发生存期（RFS）、总生存期（OS）、无远处转移生存期（DMFS）和治疗后进展率（PPS）。

1.1.5 cBioPortal数据库 采用cBioPortal（www.cbioportal.org） 数 据 库（选 择TCGA库，包括了1907例病理诊断为乳腺癌的患者）基因栏分别输入PLKs来探索其基因变化，包括突变、扩增、深度缺失和多重mRNA的变化。

1.1.6 LinkedOmics数据库 采用Linked Omic（shttps://www.linkedomics.orglogin.php）数据库分析基因（如PLK1、PLK2）表达水平之间的关系。

1.1.7 功能富集和生物信息学分析 在该数据库输入研究基因，物种选择智人。出现的富集分析结果包括细胞亚定位（CC）、生物过程（BP）和分子功能（MF），pathway内可见相关信号通路。

1.2 结果

1.2.1 PLKs在各肿瘤中的差异表达使用Oncomine数据库得到了一张差异全景图，比较乳腺癌样本和对照样本中PLKs mRNA的差异表达。其中有11个数据集显示，乳腺癌患者中PLK1mRNA的表达水平上调，6组数据显示PLK4高表达。见封二彩图3。

1.2.2 PLKs表达与乳腺癌患者临床病理特征的关系 乳腺癌样本中PLK1、PLK4的水平高于正常样本，见封二彩图4。应用UALCAN数据库分析了PLKs的mRNA表达水平与乳腺癌肿瘤分期关系、与乳腺癌患者生理年龄段的关系、与乳腺癌种类分型关系、与乳腺癌淋巴转移分期的关系以及其与TP53突变的关系，见封二彩图5～6、封三彩图1～3。在UALCAN数据库中，目前还没有PLK5与乳腺癌临床病理参数关系的研究数据。PLK1、PLK4在乳腺癌整个肿瘤分期、乳腺癌患者全年龄、所有临床类型乳腺癌、乳腺癌各级淋巴结转移和TP53突变中均高表达，而PLK2、PLK3呈低表达或无统计学意义。

1.2.3 PLKs表达与乳腺癌患者预后的关系PLK1、PLK4高表达降低了RFS、OS及DMFS。同时PLK1、PLK3和PLK4的高表达降低了PPS。而PLK3和PLK5高表达增加了RFS，PLK2和PLK5高表达增加了DMFS。见表1。

表1 PLKs表达与乳腺癌患者RFS、DMFS、OS和PPS的关系

1.2.4 乳腺癌患者中的PLKs基因突变情况28例（1.52%）乳腺癌样本中的PLKs发生了改变。突变、扩增、深度缺失和多重mRNA变化的频率分别为1%、0.21%、0.26%和0.05%。根据乳腺癌病理分型和细分结果展示，乳腺浸润性导管癌1473例，PLKs突变22例（1.49%），其中突变、扩增、深度缺失和多次mRNA变化的发生率分别为0.95%、0.27%、0.2%和0.07%。229例乳腺浸润性小叶癌中，5例（1.67%）PLKs异常突变，出现了突变和深度缺失，发生率分别为1.34%和0.33%。在89例乳腺导管和小叶混合癌中，只有1例（1.12%）发生PLKs突变。见图1。

图1 乳腺癌PLKs基因突变情况

1.2.5 乳腺癌中PLKs之间的关系PLK1与PLK2（=－0.2999，＜0.05）、PLK3（=－0.1596＜0.05）和PLK5（=－0.1798＜0.05）呈负相关，而PLK1与PLK4（=0.7264＜0.05）呈正相关。PLK2与PLK3（=0.0950＜0.05）呈正相关，与PLK4（=－0.1933，＜0.05）呈负相关。PLK3与PLK4呈负相关（=－0.2683，＜0.05），PLK3与PLK5呈正相关（=0.1599，＜0.05）。PLK4与PLK5呈负相关（=－0.2086＜0.05）。PLK2与PLK5之间无显著相关性。

1.2.6 乳腺癌中PLKs富集情况的分析为了进一步研究PLKs在乳腺癌中的作用，我们基于David数据库对PLKs进行了功能富集分析。如图2所示，有19个GO项目被富集。PLKs富集在以下生物过程（BP）：蛋白质磷酸化，有丝分裂细胞周期G2/M过渡过程负调控，G2DNA凋亡损伤检查点，有丝分裂细胞周期检查点，DNA损伤反应、信号转导p53介质导致细胞周期阻滞，蛋白酶体依赖泛素蛋白分解代谢过程调节，有丝分裂细胞周期G1/S过渡，肽基础丝氨酸、磷酸化，有丝分裂及凋亡过程的负调控。细胞亚定位（CC）：PLKs与中心体、核仁、染色质、突触、中心粒和细胞质相关。分子功能（MF）：PLKs与蛋白丝氨酸/苏氨酸激酶活性、ATP结合和蛋白激酶活性相关。只有一个KEGG通路在PLKs中富集，即FoxO家族信号通路。

图2 PLKs的GO富集分析（David）

2 讨论

PLK1可能在肿瘤的侵袭生长和淋巴及远处转移中发挥作用。研究发现，PLK1的阳性表达率在乳腺癌组织中明显高于癌旁组织，表明PLK1过表达可能导致非整倍体的出现，使染色体不稳定。此外，PLK1与乳腺癌的淋巴结转移、pTNM分期相关，提示PLK1与乳腺癌组织的侵袭生长、转移相关，可能是乳腺癌患者预后的重要指标[10]。Maire等[11]发现，与LA、LB和HER-2的乳腺癌类型相比，PLK1在三阴性乳腺癌（TNBC）中的表达水平更高。据报道，PLK1在多种人类癌症中高表达，抑制PLK1可降低癌细胞的存活率，诱导细胞凋亡，增加细胞化学药物的敏感性，且对正常细胞影响不大[4]。由于TNBC没有特异性的治疗靶点，而PLK1在TNBC中高表达，因此使用PLK1抑制剂治疗TNBC可能是一种可行的方法。TNBC比其他亚型乳腺癌更具侵袭性，长期复发率更高，预后更差，同时缺乏ER、PR和HER-2的表达。因此，针对其他亚型乳腺癌的有效靶向药物对TNBC的治疗效果较差。目前，TNBC的治疗仍以传统化疗为主，但TNBC患者要承受化疗的巨大毒副作用，可体内的肿瘤却对化疗药物不敏感，因此，PLK1及其抑制剂在TNBC治疗中的研究仍值得进一步探索。

PLK2具有许多细胞外周期效应，如促进细胞分化、抑制肿瘤形成及参与突触激活后的重构等。PLK2在肿瘤细胞的增殖和存活中有着重要作用，可能是癌症治疗的潜在靶点[12]。本研究结果显示PLK2的表达与PLK1的表达呈负相关。PLK2高表达可提高乳腺癌患者的DMFS，猜测PLK2可能在乳腺癌的发生和病情发展过程中起着负调控作用。

PLK3可以抑制ER阳性乳腺癌的细胞增殖。Naik等[13]研究发现，抑制乳腺癌细胞中的PLK3活性可导致乳腺癌细胞的异常增殖。因此，推测PLK3和雌激素敏感性指状蛋白（Efp）可能参与了ER阳性的乳腺癌患者内分泌治疗出现耐药的过程。在ER阳性乳腺癌中，雌激素可促进Efp的高表达，从而加速PLK3的降解，这对于雌激素依赖的ER阳性乳腺癌细胞的增殖是更有利的。故PLK3表达的变化可能影响着内分泌耐药的形成。

PLK4，也被称为SAK或STK18，在异种移植瘤动物模型中，药物抑制PLK4的表达或降低其活性可抑制肿瘤细胞增殖，促进细胞凋亡，抑制肿瘤生长[14]。本研究结果显示，乳腺癌患者中PLK4高表达降低了OS、DMFS、PPS和RFS。在相关性研究中，PLK4与PLK1两者表达呈正相关，进一步说明PLK4具有致癌作用。

PLK5与PLK2、PLK3有很大的同源性[9]。PLK5蛋白主要位于细胞核，PLK5表达可抑制G1期进入S期，诱导氧化应激和DNA损伤反应，在细胞中的作用主要表现为增殖细胞的下调和静止细胞的积累[9，15]。本研究，PLK5的高表达提高了患者的RFS和DMFS。

本研究系统分析PLKs在乳腺癌患者中的mRNA表达水平、突变程度及预后价值后，结果显示PLK1和PLK4过表达与乳腺癌患者生存预后不良相关，且PLK1在乳腺癌中的表达与PLK4的表达呈正相关。乳腺癌中PLK2与PLK3表达正相关，乳腺癌中PLK3与PLK5表达正相关，PLK2与PLK5不相关。PLK2、PLK3和PLK5过表达提示预后良好。