2种抗光肩星天牛杨树树皮和木质部生化物质分析

魏建荣，闫诗谣，李 臻，王 磊，刘宇婷，刘建凤*

(1.河北大学 生命科学学院，生命科学与绿色发展研究院，河北 保定 071002；2.中国林业科学研究院 沙漠林业实验中心，内蒙古 磴口 015200；3.河北省地质实验测试中心，河北省矿产资源与生态环境监测重点实验室，河北 保定 071051)

杨树是我国西北地区防护林的主栽树种[1]。光肩星天牛(Anoplophoraglabripennis)(鞘翅目：天牛科)是杨树的主要蛀干害虫，广泛发生于“三北”地区，在欧美也有发现[2-3]。西北地区早期杨树防护林网一度被光肩星天牛毁灭[4-6]。新疆杨(Populusalbavar.pyramidalis)树形高大，易繁殖、速生，是目前西北地区防护林的主栽树种[7]，对光肩星天牛具有一定抗性，但也受到其危害，由于新疆杨主要是木质部受害，树皮外观受害不太明显[8-9]。

沙林杨(Populusdeltoides‘Shalinyang’)(原名北抗杨)是耐寒旱和生长速度较快的品种[9-11]。其树形较为高大，树干表面粗糙、干裂且有沟痕。观察发现光肩星天牛主要危害沙林杨的树皮，通过解剖受害木，发现天牛幼虫的死亡率极高，但幼虫死亡原因尚不清楚[9]。由于在试种早期发现沙林杨易受光肩星天牛侵害，在王志刚等[9]的研究报告之前，未有学者对沙林杨的抗虫性进行研究。

杨树体内的次生代谢物质如酚类、黄酮类和单宁等，以及一些酶类对害虫的生长发育、繁殖有不良影响，或致其死亡[12-19]。美洲黑杨抗虫的主要机制是增加酚甙类物质[17]，但具体的化合物种类不详。为解析新疆杨和沙林杨的抗虫机制，为后期培育新型抗虫杨树奠定基础，本研究以二者为对象，选取未受害和受光肩星天牛危害的2种杨树的树皮和木质部，测定其营养物质、次生代谢物质含量和防御酶活性，分析各物质在不同处理间的异同。

1 材料与方法

1.1 采样点

采样地点位于内蒙古磴口县中国林科院沙漠林业实验中心(40°20′22.20″N，106°56′29.91″E)。该地属于温带大陆性季风气候，海拔1 000～1 080 m，年均降水量约103 mm，年均气温7.8 ℃左右。

1.2 材料

试验林为新疆杨和沙林杨混交林分，模拟防护林栽植，共2行，行距2 m，每行交叉种植2种杨树，株距1 m，树龄4 a，生长良好。光肩星天牛在该处试验林危害较轻，前期调查受害株率不超过5%，其中受害树上的光肩星天牛排粪孔数为1～3个。由于对食叶害虫开展化学防治，因此基本没有其他害虫危害。2018年9月砍伐当年受害和未受害新疆杨与沙林杨各3株，木段截成60 cm长，保鲜膜包好运回实验室，-20 ℃保存。对于未受害树，确保树干、枝上没有天牛危害或产卵痕迹。由于初期沙林杨生长量大于新疆杨，因此在选择样树时尽量挑选生长量接近的沙林杨和新疆杨，截取木段直径均为8 cm左右。分别选择未受害与受害树的树皮和木质部作为供试材料，每种处理3个重复，每重复取15 g 样品。对于受害树段，样品取自距离天牛排粪孔1～10 cm的部位，避开排粪孔和虫道。

植物可溶性糖、蛋白、植物总酚、总超氧化物歧化酶(T-SOD)、苯丙氨酸解氨酶(PAL)、多酚氧化酶(PPO)和过氧化物酶(POD)测试盒购自建成生物研究所。单宁和类黄酮购自上海仁捷生物科技有限公司。水杨苷、亚麻木酚素、毛蕊花糖苷、槲皮苷、白杨甙购自上海源叶生物科技有限公司(纯度均大于≥95%)。

1.3 方法

1.3.1 可溶性糖和蛋白质含量测定 可溶性糖含量测定采用蒽酮比色法，将样品制备后置于波长630 nm的可见光区下进行比色。蛋白含量采用考马斯亮蓝法，将样品制备后置于波长595 nm的可见光区下进行比色(具体计算方法略)。

1.3.2 次生代谢物质含量测定 采用高效液相色谱法进行分析。称取2 g样品磨碎，加入10 mL预冷50%乙醇溶液，4 ℃浸提过夜。3 000 r·min-1离心10 min，取上清液，过滤后静置待测。色谱条件：RIGOLL 3000高效液相色谱仪(Kromasil C18反相色谱柱250 mm×4.6 mm×5 μm)，柱温30 ℃，流速1 mL·min-1，进样10 μL。流动相分别是甲醇和1%甲酸水溶液，按一定梯度进行洗脱。检测器波长设置为275 nm。

制作标准曲线。取各次生代谢物质的标准品，甲醇溶解后，配置成5～6个不同质量浓度(1～200 μg·mL-1)的标准溶液，采用色谱依次检测各标准溶液的峰面积，计算得到各物质的标准曲线。由标准曲线可计算各次生代谢物质含量。总酚苷含量为5种次生代谢物质含量之和。

利用单宁在碱性环境下与磷钼酸反应生成蓝色化合物的性质进行测定；利用福林酚比色法测定总酚含量；利用类黄酮与铝离子在碱性亚硝酸盐溶液中形成红色络合物的性质测定类黄酮含量(具体方法略)。

1.3.3 防御酶活性测定 参考南京建成生物工程研究所的试剂说明书进行检测(具体计算方法略)。

1.4 数据分析

2 结果与分析

2.1 可溶性糖与蛋白含量

由表1可知，可溶性糖含量在样品间差异显著(F=6.56，df=7,16,P<0.01)，未受害新疆杨树皮最高。受害沙林杨木质部的糖含量最低(P<0.05)。样品间蛋白质含量差异显著(F=3.21，df=7,16,P<0.05)，受害新疆杨木质部显著高于未受害沙林杨木质部。

表1 2种杨树树皮与木质部的可溶性糖和蛋白质含量

2.2 次生代谢物质

不同次生代谢物质在样品间的含量差异明显，一般在树皮中的含量显著高于木质部中的含量(表2)。水杨苷含量在2树种未受害树皮间没有差异；受害新疆杨树皮高于受害沙林杨树皮(P<0.05)；未受害的木质部高于受害木质部(P<0.05)。沙林杨树皮的亚麻木酚素含量均显著低于新疆杨树皮的含量(P<0.05)；未受害木质部的含量高于受害木质部的含量(P<0.05)。未受害树皮的毛蕊花糖苷含量间无显著差异；受害树皮的含量显著低于未受害树皮(P<0.05)；受害后，沙林杨树皮的含量低于新疆杨树皮(P<0.05)，新疆杨木质部含量最低(P<0.05)；受害沙林杨木质部含量比未受害时略高，但不显著(P>0.05)。未受害沙林杨树皮槲皮苷含量最高，受害后新疆杨树皮中含量显著高于沙林杨树皮(P<0.05)。受害新疆杨树皮和木质部中的白杨甙含量均分别高于未受害树皮和木质部，沙林杨受害后含量未见升高。总酚苷含量是上述5种酚苷含量之和，在树皮中的含量远超木质部中含量(F=713.90，df=7,16,P<0.01)。其中未受害新疆杨树皮的含量高，受害沙林杨木质部最低。

表2 2种杨树树皮与木质部的次生代谢物质含量

未受害样品单宁含量比受害样品高，其中未受害新疆杨树皮最高。受害样品的总酚含量均显著低于未受害样品(P<0.05)，未受害沙林杨木质部的含量最高(P<0.01)，2种树受害木质部的含量均低(P<0.01)。受害样品的类黄酮含量均显著高于未受害样品的含量(P<0.01)。

综合分析，未受害沙林杨树皮中的槲皮苷、白杨苷以及新疆杨树皮中亚麻木酚素和类黄酮的含量较高，可能参与了沙林杨或新疆杨树皮的组成型化学防御。总酚在未受害的沙林杨木质部中含量较高，其作用还有待证实。受害后，2种树皮除单宁和类黄酮外含量相似处，其他次生代谢物在新疆杨中的含量较高，沙林杨木质部中毛蕊花糖苷的含量高于新疆杨木质部。类黄酮在受害树体内的含量高，可能与受害有一定相关性。另外，还需结合幼虫分别在不同树种的树皮和木质部取食时间长短来评估次生代谢物的作用。

2.3 防御酶

由表3可见，部分防御酶活性在杨树受害后有不同程度提高。如受害沙林杨木质部的SOD活性最高，未受害沙林杨树皮的活性最低(P<0.01)。受害沙林杨树皮PAL活性显著低于受害新疆杨树皮活性(P<0.01)，而受害沙林杨木质部更低。未受害沙林杨树皮的PPO活性最高，受害沙林杨木质部的活性最低。受害沙林杨体内的POD活性均显著提高(P<0.01)。

表3 2种杨树树皮与木质部的防御酶活性

对上述4种防御酶在2种杨树树皮和木质部中的活性分析表明，受害沙林杨的SOD酶和POD酶活性增强与光肩星天牛幼虫的危害有关，受害新疆杨木质部中的PAL和PPO酶活性增强与天牛幼虫危害有关。

3 结论与讨论

3.1 结论

光肩星天牛危害后的沙林杨木质部可溶性糖含量较低，可能是天牛幼虫在木质部存活率低的原因之一，木质部的毛蕊花糖苷含量比较高，可能与沙林杨抗虫性有关。类黄酮含量升高与2种杨树受害有一定相关。沙林杨树皮和木质部中POD和SOD酶的活性增高与天牛幼虫危害有关，且POD酶可能参与了沙林杨的抗虫反应。受害新疆杨木质部中的PAL和PPO酶升高也与天牛钻蛀危害有关。

3.2 讨论

新疆杨是我国西北地区广泛栽植的优良防护林树种，对光肩星天牛有较强的耐受性，虽然沙林杨树皮受害较为严重，但木质部受害轻于新疆杨[9]，2种杨树的抗虫机理明显不同。不同树木所含物质的质和量不同，将直接影响植食性昆虫的寄主选择、生长发育和存活[20-21]。

光肩星天牛在沙林杨木质部内的虫道远少于新疆杨木质部[9]，本研究中沙林杨受害后其木质部只有毛蕊花糖苷的含量高于受害新疆杨木质部，且略高于其受害后的树皮和未受害时的木质部，据此推断毛蕊花糖苷与沙林杨抗虫性相关。白杨甙是毛白杨的主要抗光肩星天牛物质[14]，本研究中受害新疆杨树皮和木质部中的白杨甙含量也较高，但考虑到天牛幼虫在新疆杨木质部的高存活率和在沙林杨木质部的低存活率[9]，认为白杨甙在此并未起到抗虫作用。类黄酮与光肩星天牛的危害有关，但能否起到防御作用，还有待进一步研究。

未受害新疆杨树皮中的防御酶活性高，说明其具有潜在的抗病虫性，这可能是光肩星天牛在新疆杨上产卵较少的原因之一[22]。SOD酶活性在2种杨树的受害树皮和木质部内均有不同程度的增强，说明其参与了2种杨树的诱导性防御。沙林杨受害后其树皮和木质部POD酶活性均有提高，说明POD酶参于了沙林杨对光肩星天牛幼虫的抗性反应。

树木种类、年龄和生长环境的不同会影响树皮的厚度和粗糙度。同等胸径的新疆杨树皮比沙林杨树皮薄。由于次生代谢物质在树皮内的含量远高于其在木质部的含量，因此天牛幼虫在树皮内取食的时间越长，摄入的次生代谢物质量就越多。虽然新疆杨树皮所含次生物质的量较大，但由于幼虫取食少量即钻入木质部，因此幼虫的存活率反而比较高。沙林杨树皮较厚，幼虫取食时间较长而摄入较多的次生代谢物质，生长发育会受到较大影响，可能致最终无法完成发育而死亡。

本研究只检测了部分次生代谢物质和防御酶类，也可能还有其他一些未检测次生代谢类物质会影响光肩星天牛的生长发育。如果能通过生测试验确定哪些次生代谢物质可以起到关键抗虫作用，则在未来的抗虫育种工作中，可提前在苗期检测这些物质，缩短育苗、选苗周期。