冻存液添加蜂王浆主蛋白对精子品质的影响

李子清，黄金明，沈立荣，石放雄＊

1 南京农业大学动物科技学院，江苏南京 210095

2 山东省农业科学研究院畜牧兽医研究所，山东济南 250100

3 浙江大学生物系统工程与食品科学学院，浙江杭州 310058

0 引言

人工授精（Artificial insemination，AI）作为一种常见的动物繁殖技术，授精效果很大程度上取决于精液质量。常见精液的保存方法包括常温（15～ 25 ℃）、低温（0～5 ℃）和冷冻保存（-196 ℃）三种[1]。精液常温保存和低温保存方法主要应用于畜禽场短时间的精液自产自用，冷冻保存方法能够让精液长久保存乃至运输，但对设备和操作技术要求较高，冻存后的精液品质也参差不齐。此外，因精子中不饱和脂肪酸和卵磷脂含量较高，极易在冷冻过程中发生脂质过氧化，一定程度上降低精子的抗氧化能力[2]。以往精液冻存液会添加甘油、乙二醇等作为保护剂，但这类保护剂在冷冻-冻融过程中会促进自由基的产生，致使精子活力和受精能力降低，加剧DNA损伤[3]，影响冻存精液品质。

蜂王浆（Royal jelly，RJ）是蜜蜂中青年工蜂头部上颚腺和咽下腺共同分泌的一种淡黄色浆状物质，具有抗菌、抗炎症、抗肿瘤及抗氧化等功能，广泛应用于医疗、保健和科研等领域中[4]。RJ在动物生殖上也表现出积极作用，Husein和Kridli[5]对母羊分别进行饲喂和肌内注射RJ，发现母羊产仔数、多肽率和妊娠率显著提高。Ahmed等[6]在镉构建的大鼠睾丸损伤模型中发现，RJ对镉诱导的睾丸组织损伤有保护作用。此外，Rahnm等[7]对鸡进行口服添加RJ，发现当RJ添加量在100 mg/kg·BW时能够提高精子冷冻-冻融后的活力和质膜完整性。Amini等[8]发现，在山羊精液冻存液添加3% RJ能够显著提高精子存活率和质膜完整性，并且降低精子畸形率，而添加5%RJ能抑制精子活力和增加精子畸形率。Alcay等[9]的研究结果也呈现出相似结果，向精液冻存液中分别添加0.25%、0.5%和0.75% RJ，其中添加0.5%和0.75%RJ，均能提高精子活力和降低精子质膜完整性，并且各组间DNA损伤无显著性差异。Shahzad等[10]在水牛精液冻存液中添加0.05%、0.1%、0.2%、0.3%和0.4% RJ的试验发现，添加0.1% RJ能够显著提高精子冷冻-冻融后的活力。RJ的主要成分包括水（60% ～70%）、蛋白质（9% ～ 8%）、脂类（3% ～ 8%）、矿物质、维生素以及少量未知成分，蜂王浆主蛋白（Major Royal Jelly Proteins，MRJPs）作为RJ主要活性物质，占总蛋白含量的90%。先前的研究表明，MRJPs能够屏蔽昆虫和哺乳动物的细胞膜，使DNA、RNA免受氧化损伤，且MRJPs因其金属螯合特性而表现出强清除自由基能力[11]。然而，有关直接将MRJPs应用于精液冻存液的研究尚未见报道。因此本试验开展了向公牛精液冻存液中添加不同浓度的MRJPs探索，以期利用MRJPs的生物学功能，在现有冻存精液品质基础上进一步提高冻存精液的品质。

1 材料与方法

1.1 试验材料

蜂王浆主蛋白冻干粉，浙江大学沈立荣教授团队提供；荷斯坦公牛精液、精液冻存液，山东奥克斯畜牧种业有限公司；细管灌装机，上海卡苏生物科技有限公司；0.25 mL精液细管，上海卡苏生物科技有限公司；DMSO-细胞培养级，北京索莱宝科技有限公司；恒温精子分析仪，美国汉密尔顿有限公司。

1.2 方法

设置1 个对照组和4 个处理组，处理组精液冻存液中依次按照0 g/25 mL、0.01 g/25 mL、0.02 g/25 mL、0.03 g/25 mL、0.04 g/25 mL的浓度添加MRJPs，再分别添加5% DMSO，促进冻干MRJPs溶解。选择精子密度≥1.0×108个/mL，活力≥95%的精液，将精液稀释至5.0×107个/mL后，依次等量添加到各组冻存液中。按照商品精液生产标准化流程完成精液的冷冻保存，并在冻存48 h后利用恒温精子分析仪完成各组精子相关参数测定（9 个视野数值×3 个重复×5 支精细管，单次重复精液用量20 μL）。最终数据结果采用One-Way-ANOVA分析，结合Duncan（假定方差齐性）和Dunnett's（伪假定方差齐性）进行多重比较， 显著性差异用标记字母法表示。

2 结果与分析

公牛精液冻存液中添加不同浓度的MRJPs对冻存精子总活力、精子直行性活力、快速前进性活力、缓慢前进性活力、畸形率和原地运动精子比率的影响结果如图1所示。冻存48 h后结果显示，MRJPs浓度0.04 g/25 mL组精子总活力显著低于对照组（P＜0.05），而MRJPs浓度0.01 g/25 mL、0.02 g/25 mL、0.03 g/25 mL 三组精子总活力与对照组无显著性差异（P＞0.05）。MRJPs浓度0.04 g/25 mL组精子快速前进性活力显著低于对照组（P＜0.05），而0.01 g/25 mL组快速前进性活力无显著性差异（P＞ 0.05）。0.04 g/25 mL组精子缓慢前进性活力显著低于对照组（P＜0.05）。MRJPs浓度0.04g/25 mL组精子前进性活力显著低于对照组和其余处理组（P＜0.05），MRJPs浓度0.01 g/25 mL组前进性活力与对照组相比无显著性差异（P＞0.05），MRJPs浓度0.02 g/25 mL、0.03 g/25 mL、0.04 g/25 mL三组前进性活力显著低于对照组（P＜0.05）。精子畸形率和原地运动精子率各处理组与对照组相比无显著性差异（P＞ 0.05）。

图1 冻存液添加MRJPs对种公牛精液冻存48 h精子参数的影响

3 讨论

本研究结果表明，精液冻存液中添加MRJPs会抑制精子活力，即除MRJPs浓度0.01 g/25 mL组与对照组精子活力无显著性差异外，其余各组（0.02 g/25 mL、0.03 g/ 25 mL、0.04 g/ 25 mL）精子活力均呈出随着MRJPs浓度的增加而呈抑制作用增强的趋势，这与之前报道中添加RJ可提高冻存精子活力的结果相反。在之前添加RJ提高冻存精液试验中，RJ添加浓度过高时，冻存后精子活力、畸形率和死亡率都会显著性升高[8，9]。Yang等[12]的研究中也表明，高剂量RJ会影响精子形态以及造成睾丸组织病理学异常。Rahnm等[7]指出，过量添加RJ相当于引入过量外源性抗氧化剂，打破了精液中原有氧化还原平衡，是精子质量下降的主要原因。同时，高慧等[13]研究发现，RJ冻干样良好的自由基清除能力以及抗氧化能力与RJ水溶性蛋白的含量呈正相关。RJ水溶性蛋白酶解后抗氧化能力得到增强[14]。从侧面印证MRJPs的抗氧化能力可能是造成冻存后精子活力受抑制的主要原因。

MRJPs是一个功能多元化的蛋白家族，包含MRJP1～9等九个成员，除决定蜜蜂的级型分化和调节蜂王的生理功能外[15]，也被报道具有类雌激素效应并促进小鼠雌激素分泌，加快卵泡发育和小鼠成熟进程的作用[16]。MRJPs中MRJP 1～5含量最丰富，MRJP-1以单体和寡聚体形式存在，其中寡聚体的形式多元化造就了MRJP-1生物活性的多样化[17]，能够促进胚胎干细胞的自我更新以及幼稚多功能性基因调控网络的出现[18]。MRJP-2在中华蜜蜂（Apis.cerana cerana）中屏蔽细胞膜，并通过降低半胱氨酸蛋白酶-3（Caspase-3）的活性诱导细胞凋亡[19]。同时，MRJP-1和MRJP-2也都作为王浆蛋白中的主要抗菌物质而存在[20]。MRJP-3则作为免疫调节蛋白，可调节IL-4、IL-2的生成，进而影响T细胞功能[21]。综上，MRJPs拥有广泛的生物学功能，且影响因子众多，也使得在对冻存精液品质的影响上观点不一。在被报道RJ提高冻存精液品质的相关试验中，除MRJPs作为主要影响因子外，不排除RJ其余成分的作用。Tamura等[22]推测在冻存液中添加RJ（0.1%）可提高精子冻存后活力，可能与RJ成分中的氨基酸（天冬氨酸、甘氨酸、半胱氨酸、赖氨酸等）有关，其中半胱氨酸可作为有效的抗氧化剂，在冷冻过程中起清除ROS的作用。此外，作为RJ特有的脂肪酸10-羟基-Δ2-癸烯酸（10-hydroxy-Δ2-dece-noicacid，10-HDA）具有抗菌、抗炎和抗衰老等强活性[23]，可能也具备提高冻存精子活力的作用。本研究表明，MRJPs添加到牛精液冻存液中会降低冻存精子活力，可能因为MRJPs的添加，致使精液中原有氧化还原平衡被破坏。今后将对RJ的不同成分、不同助溶剂、从RJ直接提取和透析得到的MRJPs与冻干粉进一步进行比较筛选，探索RJ中具有精子冷冻保存作用的成分、使用方式及作用机理。

4 结论

本文以提高冻存精液品质为目标，向牛精液冻存液中添加不同浓度MRJPs，评估冻存48 h后精子有关活力参数。在本试验条件下，冻存液添加MRJPs不能提高冻存后精子活力，反而出现抑制作用，并提出了进一步研究探索的方向。