番茄中Ty-1 抗性机制研究

黄 毅

（贵阳职业技术学院，贵州 贵阳 550081）

1 Ty-1 特性

番茄黄叶卷曲病毒（TYLCV）是世界上最具毁灭性的植物病毒之一。为了抵御这种病毒，一些抗性基因被用于育种中。植物基因组中存在的抗病基因通过产生R 蛋白，为植物抵抗病原体提供抗病能力。在这些基因中，Ty-1 抗性基因的应用最为广泛，许多商业杂交品种都携带Ty-1[1]。Ty-1 最早在1969 年智利南部发现，在最初的大规模重组筛选中首次提出了Ty-1 的简单图谱，如今已经鉴定并克隆了Ty-1 抗性基因。虽然Ty-1 不编码经典的NBS-LRR 基因，也不产生涉及超敏反应（HR），但Ty-1 影响病毒的复制或移动，含有该基因的植物表现出更多的耐受性。

RNA 沉默是一种基于序列同源性的基因调控机制，保留在真核生物中，不仅与调节基因表达有关，还抵御转座子等寄生遗传因素，并控制转基因和病毒[2]。RNA 沉默，也称为RNA 干扰（RNAi），通常被认为是植物和昆虫中的一种抗病毒防御机制，也被证明在哺乳动物中起到抗病毒作用。在RNAi 的机理过程中有4个关键部分：长双链RNA（dsRNA）、21-26 nt 短干扰RNA小链（siRNA）、内核糖核酸酶（Dicer）和RNA 诱导沉默复合物（RISC）（见图1）。

图1 RNAi 沉默机制

在植物中，RNA 病毒通过转录后基因沉默（PTGS）作为靶标，而像双子病毒的DNA 病毒则通过转录后基因沉默（TGS）作为靶标[3]。PTGS 和TGS 的抗性策略不同（见图2），TGS 通过细胞核中的DNA 甲基化与转座子的调节有关，而PTGS 通过细胞质中的长双链RNA调节病毒感染。在植物中，病毒和转基因都能通过PTG诱导基因沉默，这一过程被普遍认为是植物抵御某些病毒病原体感染的组成部分。

图2 基因沉默和转录后基因沉默模型

RNA 诱导DNA 甲基化（RdDM）已被植物用作对抗双子病毒的表观遗传防御[4]（见图3）。在RdDM的过程中，涉及两种关键酶——RDR2 和DCL3。RDR2 是一种功能酶，可调节内源性植物siRNA 和病毒次级siRNA的生物合成，并在RdDM途径中靶向dsRNA 的转化。dsRNA 被消化成大小不同的siRNA，主要是24nt（由DCL3 产生）、21nt（由DCL4 产生）和22nt（由DCL2 产生）。不同大小的siRNA 具有不同的功能，例如，24-nt siRNA（与DCL3 相关）可能指导病毒DNA 甲基化和转录沉默。DCL3 是一种RNA 酶Ⅲ样酶，属于由4 个原型成员组成的家族，参与RDR 最后一步，以帮助24-nt siRNA 的发生。重要的是，DCL3 和24-nt siRNA 显然与染色质甲基化有关。

图3 RNA 诱导DNA 甲基化模型（Pooggin 2013）

2 研究目标

分析Ty-1 是否对其他双子病毒有抗性，Ty-1 番茄植株将受到BCTV 侵染，将其与易感MM系的含量进行比较分析。根据最新研究，Ty-1 不是TYLCV 的特异性，也可以对抗其他双子病毒甚至其他DNA 病毒，例如，Ty-1 似乎也能控制不同（双组分）双病毒物种的耐受性反应，如ToSRV。但是几乎没有关于Ty-1 对其他病毒的耐药性研究[5]。

3 试验方法

3.1 植物

番茄试样MM、Ty-1、Ty-2 的种子在土壤中，24 ℃和60%相对湿度的温室条件下，光照16 h、夜间8 h 养护3 周生长。烟草置于相同的温室条件下。在接种大约3～4 周后，将番茄试样的顶部叶片采摘并在-20 ℃下储存至使用。

3.2 TYLCV，BCTV，ToSRV 接种

用番茄黄叶卷曲病毒、甜菜卷曲顶病毒或番茄皱纹病毒对番茄品系进行接种。将含有该病毒克隆的根癌农杆菌（A.tumefaciens）转化并在3 mL LB3 培养基中与6 μL 卡那霉素和3 μL 利福平抗生素一起培养。液体培养物在28 ℃温度下以180 rpm 摇动过夜。第二天，将600 μL 过夜培养基转移到3mL 诱导培养基中，相同条件下培养。悬浮在3 mL MS-MES 培养基中，样品以3 500 rpm 离心20 min 后充分混合。测量OD600为0.5 时稀释。在温室条件下，用无针注射器加压5 mL接种，对3 周龄番茄植株进行渗透。

3.3 DNA 提取和PCR 分析

为了确认敏感番茄试样中是否存在BCTV 的DNA，设计BCTV 引物进行PCR 正向引物（5`-TGTAVT VVGATVGAGCGTGTT-3`）和反向引物（5`-TCATACAA CGAACACTTCATGA-3`），产物长度为700 bp。

从6 周幼苗中分离DNA，用液氮中研磨1 g 植物样后，与分离DNA 缓冲液混合。用Eppendorf 旋转约2 min 后，以12 000 rpm 的转速旋转5 min，将透明液体移到新管中。洗涤后用离心机以12 000 rpm 的速度去除多余液体。向每根试管中加入30 μL 的G.lig EB，等待3 min。试管在12 000 rpm 下旋转2 min 后准备进行PCR。使用1ul DNA 提取物作为模板，检查DNA 片段扩增。

4 结果

4.1 BCTV 克隆成功感染Nicotiana benthamiana

BCTV 对番茄品种和烟草影响不同。对于番茄而言，其会导致植株发育迟缓、变黄、叶脉膨胀变紫、向上卷曲叶片。其对烟草特有的症状是向下卷叶和发育迟缓。

在测试Ty-1 是否也具有对不同于TYLCV 的双子病毒的抗性之前，将BCTV 的一种PGV 3850 农杆菌克隆接种在本氏烟上，测试其传染性。PGV 3850 接种后13 d，本氏烟下叶出现黄变、坏死等症状。为了确认是否存在BCTV，采用特异性PCR 引物检测病毒的存在。结果显示预期大小为700 bp 的条带，说明设计的引物对扩增BCTV有用，进一步说明本生烟已被BCTV感染。

4.2 Ty-1 系列表现出对BCTV 的抗性

为测试Ty-1 是否也能抵抗其他双子病毒，用BCTV 克隆对Ty-1 番茄植株进行接种，以测定感染后的病毒含量，并与敏感MM进行比较。采用烟草响尾蛇病毒（TRV）的病毒诱导基因沉默（VIGS）方法构建了两个VIGS 结构，分别用于Solyc06g051180 的TRV2-180和Solyc06g051190 的TRV2-190。

由于Solyc06g051180 和Solyc06g051190 之间同源性较低，两个VIG 载体TRV2-180 和TRV2-190 是特异性的，并且都被假定为单个RDR。含有Ty-1 的植株通过TRV2-180 或TRV2-190VIG 进行侵染沉默，出现TYLCV 疾病症状并观察抗性受损。在用BCTV 感染之前，首先用TRV2-180 和TRV2-190 对Ty-1 植株进行接种，使VIGS 沉默Ty-1 并损害其抗性。作为对照，在Ty-1 植株上接种TYLCV。Ty-1 和MM在温室中播种，1 周后移栽到不同的花盆中，用TRV2-180 或TRV2-190进行接种。约3 周后，感染叶片表现为发育迟缓、变黄、叶脉肿胀、变紫以及向上卷曲的叶片（见图4）。在对Ty-1 进行VIG 沉默的MM和Ty-1 植株上，症状清晰可见，典型症状是感染TYLCV 的叶片变黄和卷曲。对于受到BCTV 攻击的Ty-1 和MM番茄植株，这些症状表明，Ty-1 的VIGS 沉默（TRV2-180 和TRV2-190）相对于未被VIGS 沉默的Ty-1 系表现出比BCTV 更明显的症状，如严重发育迟缓、向上卷曲叶片、发育缓慢。相比之下，在BCTV 侵染的Ty-1 株系上几乎看不到症状，而少数Ty-1 植株表现出与MM相似的症状。

图4 Ty-1 和MM 分别被TYLCV 或BCTV 侵染后的症状

4.3 扩增BCTV 片段并进行PCR 检测

为了检测感染的Ty-1 番茄叶片中BCTV 含量，采用qPCR 方法对RV2-180/190 VIGS 沉默的Ty-1 植株、Ty-1 植株和易感MM 番茄中的BCTV 滴度测定。分析前，设计了一套特定的引物，从这些感染的植物样本中PCR 扩增BCTV 片段，并获得约700 bp 的产物。作为对照，加入TYCLV 感染样本，并使用设计成功的引物进行测试，得到了300 bp 的产物。在被侵染的植物中用PCR 检测BCTV 的DNA（见图5），结果显示，MM 株系和TRV2-180/190 VIGS 沉默的Ty-1 番茄植株样本分别呈现预期的DNA 产物，其中TYLCV 为300 bp，BCTV 为700 bp。由此可以证明MM 系和TRV2-180/190 VIGS 沉默的Ty-1 番茄植株系已感染BCTV。使用BCTV 引物对所有试验植物的分离样本进行PCR，以扩增BCTV，并证明所有MM 系和TRV2-180 VIGS 沉默的Ty-1 系均成功感染BCTV。但结果显示，其中一个Ty-1 样本也感染了BCTV。

图5 在被侵染的植物中用PCR 检测BCTV 的DNA

4.4 用qPCR 测定BCTV 有效量

BCTV 的侵染成功和PCR 引物的确定后，分别对Ty-1 植株、感病MM番茄和TRV2-180/190 VIGS 沉默的Ty-1 番茄叶片样本进行qPCR 检测，以确定BCTV滴度。内部对照，在Butterbach 等人的TYLCV 试验的Ty-1 的qPCR 分析中使用了GFP 基因的Ty-1 进行的qPCR 分析相同。

根据qPCR 结果，在样本中观察到不同的BCTV病毒滴度（见图6）。正如预期，从易感MM采集的大多数植物样本中普遍观察到较高的滴度，而在Ty-1 中观察到较低的滴度，但样本除外。由于Ty-1 的VIGS沉默在早期损害了对TYLCV 的抗性，因此经类似处理（TRV2-180 或TRV2-190）并随后用BCTV 激发的Ty-1 植株显示出比Ty-1 更高的滴度以及与MM相似的滴度水平，并进一步表明Ty-1 的VIGS 沉默损害了对BCTV 的抗性，结果表明Ty-1 对BCTV 具有抗性。虽然Ty-1 株系的平均滴度低于对照组，但一个Ty-1株系样本显示出比其他Ty-1 株系更高的含量（见图7）。

图6 qPCR 分析BCTV 分别侵染MM、Ty-1 lines、TRV2-180 和190 VIGS-silenced Ty-1

图7 2-ΔΔCt 方法分析qPCR 结果

5 讨论

试验植物表现出了预期症状，BCTV 的PCR 结果与阳性对照（TYLCV）相同，从而证明MM、TRV2-180或TRV2-190 VIGS 沉默的Ty-1 系感染了BCTV。通过qPCR 方法在Ty-1 系中产生的较低滴度，在大多数易感MM和TRV2-180 VIGS 沉默的Ty-1 系中产生的滴度较高，综上结果Ty-1 确实对BCTV 产生了抗性。

另外，观察到一株被BCTV 攻击的Ty-1 番茄植株表现出易感MM 番茄的症状，这株Ty-1 番茄植株被BCTV 感染，产生了更高的滴度。结果表明该Ty-1 番茄植株不对抗BCTV，Ty-1 通过增强TGS 而产生抗性。可能Ty-1 番茄植株不能产生足够的siRNA 信号，会导致TGS 抑制和RNAi 沉默失败。目前尚不清楚这种新型Ty-1 植物产生的原因和机制，因此在不久的将来对其进行研究将是一个挑战。