Yb/Er掺杂Y2O3纳米核壳颗粒的荧光性能及体内标定研究

麦金玲 王 辰 徐梁格 黄宝玥 张力图

(1.广西医科大学 肿瘤医学院实验研究部，南宁 530021；2.广西壮族自治区肿瘤分子医学工程研究中心，南宁 530021；3.哈尔滨工业大学 特种环境复合材料国防科技重点实验室，哈尔滨 150080)

因具有锐峰发射、大Stokes位移、低细胞毒性和高效磁矩等特性，稀土元素掺杂的无机上转换纳米粒子(UCNPs)近年来备受化学研究人员关注[1-2]。大量新型激活剂和敏化剂的出现，为UCNPs在荧光显示、生物体内成像标定及光热/光动力治疗等提供了广阔的应用前景[3]。为了进一步提高UCNPs的荧光性能，多种合成工艺用来增强上转换发光(UCL)强度和颜色调变，比如高功率激发、掺杂剂分布优化及惰性层包覆等[4-5]。此外，UCNPs在生物医学领域应用时对粒径要求十分严格，超过100 nm的颗粒往往不易被细胞吞噬，无法实现相关检测与治疗过程。目前，小尺寸UCNPs的制备工艺主要为溶胶-凝胶法、水热/溶剂热和高温溶剂法等[6]。但相关制备工艺复杂，设备环境要求苛刻(无水、无氧等)，且成本较高，产率较低，不利于体内标定物的大规模制备和临床推广[7]。

为此，本实验利用高产率、低成本的共沉淀法代替上述合成方法[8]。利用Yb/Er共掺杂方式合成了尺寸较小的纳米Y2O3：Yb3+，Er3+@Y2O3：Yb3+核壳颗粒，并通过Yb3+掺杂浓度和水浴时间的调变，实现了高强度、长寿命的红色荧光主导发射，并对比了红绿双信道的荧光成像体内标定效果。

1 实验部分

1.1 试剂与仪器

主要原料有氧化钇(Y2O3，99.9%)、氧化铒(Er2O3，99.9%)、氧化镱(Yb2O3，99.9%)、浓硝酸(HNO3，AR)、尿素(CH4N2O，AR)，涤洗溶剂为无水乙醇(C2H5OH，AR)，超纯水通过实验室超纯水系统制得(力康，PWVF型)。

检测仪器主要有X射线衍射仪(XRD，Rigaku，Japan，D/max TTR-Ⅲ，Cu-Kα射线，λ=0.15405 nm，扫描速度15°/min，扫描范围20°～80°)；透射电子显微镜(TEM，JEOL，Japan，JEM-3010，加速电压200 kV)；荧光光谱仪FLS980(Edinburgh，K98D08M-30 W，980 nm照射源，范围400～800 nm)；小动物成像系统(Analytik Jena，UVP iBox Explorer)。

1.2 Yx(OH)y(CO)z：Yb3+，Er3+内核的制备

按照摩尔百分比Y∶Yb∶Er=89∶10∶1的比例称取0.1 mol Y2O3/Yb2O3/Er2O3粉末。将粉末混合后投入烧杯中，加入过量浓HNO3并加热，使其逐渐溶解制得Y/Yb/Er稀土硝酸盐溶液。用容量瓶将此溶液配至1 mol/L，并用移液器吸取1 mL注入100 mL烧杯内，再依次加入3 g尿素及50 mL超纯水，连续搅拌5 min。随后，将烧杯置于90 ℃水浴锅内加热3 h。反应液冷却后经离心(1 700 r/min，7 min)处理，辅以超纯水和无水乙醇交替涤洗3次，留得前驱体Yx(OH)y(CO)z：Yb3+，Er3+沉淀备用。

1.3 Y2O3：Yb3+，Er3+@Y2O3：Yb3+核壳颗粒的制备

采用梯度掺杂的方式进行壳层成分设计，并去除Er3+形成发光惰性层，以减少表面缺陷且提高荧光强度。首先，参照内核的元素比例设计，按Yb(40%)、Yb(80%)、Yb(160%)、Yb(320%)、Yb(640%)的比例，称取Y2O3/Yb2O3粉末，并利用前述工艺制得1 mol/L Y/Yb稀土硝酸盐溶液。随后，另取250 mL烧杯并注入100 mL蒸馏水，倒入3 g尿素和全部前驱体Yx(OH)y(CO)z：Yb3+，Er3+沉淀，搅拌5 min。最后，加入1 mL Y/Yb稀土硝酸盐溶液，补水至200 mL后进行水浴加热(90 ℃，3 h)。产物经离心涤洗后得到Y2O3：Yb3+，Er3+@Y2O3：Yb3+核壳颗粒，60 ℃干燥备用。

此外，将Yb3+浓度固定为80%，用相似步骤再次合成Y2O3：Yb3+，Er3+@Y2O3：Yb3+核壳颗粒，水浴时间分别调整为1、2、4、8、16 h。

1.4 Y2O3：Yb3+，Er3+@Y2O3：Yb3+核壳颗粒的性能表征

利用TEM观察纳米颗粒的显微形貌。利用XRD进行样品的物相分析。利用荧光光谱仪FLS980在980 nm(c.w.连续波)和脉冲激光激发下分别测量纳米粒子的UCL光谱和衰减曲线(电流设置为2.00 mA)。利用小动物成像系统在小鼠体内进行纳米颗粒的荧光成像。为了准确比较各组UCNPs的UCL性能，所有UCNPs均在室温相同条件下进行表征。

2 结果与讨论

2.1 Y2O3：Yb3+，Er3+@Y2O3：Yb3+纳米核壳颗粒的形貌及物相分析

在共沉淀法制备纳米核壳材料时，水浴时长可以影响沉淀析出量且改变壳层厚度，改变核壳材料的光学性能。图1为不同水浴时间下Y2O3：Yb3+，Er3+@Y2O3：Yb3+核壳颗粒的显微形貌照片及其颗粒尺寸分布，且水浴时间从a至e逐渐增加。结合电镜照片、粒径分布图和统计数据(表1)可知，该颗粒的平均尺寸在25.57～26.24 nm范围内变化，且随着水浴时间的延长，包覆层厚度和样品的平均粒径逐渐增大。在壳层包覆初始阶段(2 h内)，UCNPs的粒径增长较为缓慢；4～8 h时，颗粒尺寸迅速增加；随后，纳米粒子的大小趋于稳定，包覆层厚度增加放缓。值得注意的是，在粒径高速增加的阶段，离散度明显加大，其均一性会受到影响。而经较长时间的包覆后(16 h)，其粒径呈集中分布趋势，说明其尺寸稳定性最优。

图1 不同水浴时间下Y2O3：Yb3+，Er3+@Y2O3：Yb3+核壳颗粒的TEM图及其粒度分布Figure 1 TEM image and size distribution of Y2O3：Yb3+，Er3+@Y2O3：Yb3+ core-shell particles in different water bath time.

表1 不同水浴时间Y2O3：Yb3+，Er3+@Y2O3：Yb3+核壳颗粒的粒径平均值Table 1 The average particle size of core-shell Y2O3：Yb3+，Er3+@Y2O3：Yb3+ particles at different water bath time

通过XRD图谱(图2)分析该纳米核壳颗粒的物相成分，结果显示所有衍射峰的出现位置和相对强度都与Y2O3标准峰匹配，说明该UCNPs颗粒的基质相为Y2O3。图谱中衍射峰为锐峰，且无明显杂峰，印证了该工艺下纳米颗粒结晶完好，无其它副产物，这有效地保障了UCNPs的荧光发射能力。

图2 Y2O3：Yb3+，Er3+@Y2O3：Yb3+核壳颗粒的XRD图Figure 2 XRD pattern of Y2O3：Yb3+，Er3+@Y2O3：Yb3+ core-shell particles.

2.2 Y2O3：Yb3+，Er3+@Y2O3：Yb3+纳米核壳颗粒的UCL光谱分析

为了探究成分与合成工艺对UNCPs荧光性能的影响，分别选择Yb3+浓度和水浴时间作为调变因素，对其荧光性能影响进行深入分析。由图3可知，在室温980 nm连续波激光条件下，该UCNPs在661 nm波长附近出现窄带红光发射，对应发光中心Er3+的4F9/2→4I15/2跃迁。其他条件不变，当Yb3+浓度从40%倍数增加至640%时，其荧光发射强度呈先增加后减少的趋势，且80%时发光强度最高(如图3a所示)。由此可见，过高和过低的敏化剂浓度均会严重影响发光效果。低浓度敏化剂不能充分传递光子，而浓度过高则会形成浓度淬灭[9]。在此基础上，确定Yb3+浓度为80%，将水浴时间从1 h增加至16 h，可以发现2 h内其发光强度变化不大，随后出现明显上升和下降，且经8 h水浴的UCNPs获得最高荧光强度(如图3b所示)。结合图1显微结构观察结果，说明水浴时间的适当延长、惰性层厚度在合理范围内的增加，有利于改善表面缺陷，使发光强度逐渐提高。但是，过厚的惰性层会影响敏化剂光子传递效率，导致荧光发射强度降低。

图3 Y2O3：Yb3+，Er3+@Y2O3：Yb3+核壳颗粒的UCL发射光谱图：(a) 不同Yb3+离子浓度；(b) 不同水浴时间Figure 3 UCL emission spectra of Y2O3：Yb3+，Er3+@Y2O3：Yb3+ core-shell particles：(a) Different concentration of Yb3+ ion；(b) Different bath time.

此外，根据荧光发射光谱结果，进一步计算了Y2O3：Yb3+，Er3+@Y2O3：Yb3+核壳颗粒荧光发射的红绿比(如图4所示)。所有试样的红绿比均大于1，因此可知该UCNPs为红光发射主导。但过高和过低的红绿比会影响生物成像识别与标记，居中的红绿比效果较为理想，更适合用作体内标定及成像研究[10]。

图4 Y2O3：Yb3+，Er3+@Y2O3：Yb3+核壳颗粒的红绿比：(a) 不同Yb3+离子浓度；(b) 不同水浴时间Figure 4 The red/green ratio of Y2O3：Yb3+，Er3+@Y2O3：Yb3+ core-shell particles：(a) Different concentration of Yb3+ ion；(b) Different bath time.

2.3 Y2O3：Yb3+，Er3+@Y2O3：Yb3+核壳颗粒的UCL寿命分析

在微秒级范围内，荧光寿命的增加有利于提升荧光标记物在生物体内的检测精度，并降低操作难度。为此，在611 nm红光处测试了Y2O3：Yb3+，Er3+@Y2O3：Yb3+核壳颗粒的荧光衰变曲线，并计算了相关参数(如图5，表2，表3所示)。当Yb3+浓度逐渐增加时，荧光寿命先增加后减小，且160%Yb试样的寿命最长(56 μs)，40%Yb试样的寿命最短(37 μs)。虽然长寿命有利于荧光成像及标定，但是过高的稀土离子浓度，可能对生物体内长循环代谢具有不确定性影响。因此，在80%Yb试样和160%Yb试样有相近荧光寿命的情况下，更倾向选择低浓度试样作为标定物。在不同水浴时间试样的荧光寿命对比中，经8 h水浴UCNPs的寿命最长，且与高浓度Yb3+试样相仿。这说明80%Yb试样可以通过恰当的包覆工艺，有效延长荧光衰减寿命，更适合小动物体内成像及标定过程使用。

图5 Y2O3：Yb3+，Er3+@Y2O3：Yb3+核壳颗粒的寿命曲线：(a) 不同Yb3+离子浓度；(b) 不同水浴时间Figure 5 Decay curves of Y2O3：Yb3+，Er3+@Y2O3：Yb3+ core-shell particles：(a) Different concentration of Yb3+ ion；(b) Different bath time.

表2 不同Yb3+浓度的UCL寿命曲线拟合结果Table 2 The results of UCL lifetime curve fitting with different Yb3+ concentrations

表3 不同水浴时间的UCL寿命曲线拟合结果Table 3 The results of UCL lifetime curve fitting with different water bath time

2.4 Y2O3：Yb3+，Er3+@Y2O3：Yb3+纳米核壳颗粒的生物体内标定

选取代表性试样(80%Yb，8 h水浴)进行小动物成像，并对体内特征点位进行标定(如图6)。首先，在980 nm激光辐照下，注射有代表性试样的小鼠，其体内荧光图像的强度分布明显不同(如图6a所示)。分别利用绿色(图6b)和红色(图6c)通道进行信号采集，并做热图分析可知，试样主要集中在小鼠的主要脏器及尾静脉注射部位。通过对比图6b和6c能够发现，红色通道的信号强度(I0=771.92 cps)及对比度明显比绿色通道的(I0=216.83 cps)要高，这是由于注射的UCNPs试样红绿比较高造成的。此外，对小鼠肺部进行点位标定处进行定量分析，相同位置红色信道的强度值显著高于绿色信道(如图6b和6c黑色十字交点位置)。由此可知，该试样更适合红色通道进行信号采集。

图6 Y2O3：Yb3+，Er3+@Y2O3：Yb3+核壳颗粒的小动物成像图：(a) 原始荧光；(b) 绿光分布热图；(c) 红光分布热图Figure 6 Animal images of Y2O3：Yb3+，Er3+@Y2O3：Yb3+ core-shell particles：(a) Original fluorescence；(b) Heat map of green light；(c) Heat map of red light.

3 结论

1)包覆层厚度和样品的平均粒径会随着水浴时间的增加而逐渐增大，变化范围在25.57～26.24 nm。

2)经8 h水浴的80% Yb掺杂Y2O3UCNPs荧光发射强度最高，且红绿比居中，荧光寿命较长，有利于作为小动物体内成像及标定物。

3)Y2O3：Yb3+，Er3+@Y2O3：Yb3+UCNPs试样更适用于红色信道检测，荧光强度值更高。