果树多倍化育种研究进展

王利虎，卢彦琦，苏行，张琼，赵志军，陈敬谊*，丁保朋

（1.河北工程大学 园林与生态工程学院，河北 邯郸 056038；2.山东省果树研究所，山东泰安 271000；3.山西农业大学林学院，山西 晋中 030801；4.山西农业大学 园艺学院，山西 晋中 030801）

多倍体（polyploid），即获得2 套以上的染色体［1］，多倍化是真核生物进化中的一个重要因素［2］，其多发生于植物中，在进化过程中发挥重要作用［3］，也是植物多倍体化研究的热点［4］，几乎发生在所有植物物种的谱系中［3］，30%～70%的被子植物被认为是多倍体祖先［1，5］，随着测序技术的快速发展，越来越多的证据表明，多倍化在植物物种多样性、基因进化和作物驯化中发挥着重要作用。

多倍体育种是目前最受育种学家欢迎的育种方法之一，与传统育种方法相比，该技术应用范围更广泛，最大的优点是耗时短，易于操作，能快速创制新种质材料，不仅可以直接作为栽培品种进行推广，还可作为中间材料进行杂交，同时还具有优良的生物学特性和农艺特性，因此多倍化育种广泛应用于育种周期长的各种果树品种。

多倍化育种在果树育种中占有重要地位，鉴于果实研究中主要为同源多倍体研究，本文主要从多倍化的意义、多倍体产生途径、多倍体鉴定方法、多倍化对果树的影响等四个方面全面综述其在果树多倍化育种的研究进展，以期为今后的果树多倍化育种乃至其他植物上的多倍化研究提供理论参考和借鉴。

1 多倍体化在进化及应用上的意义

科学界普遍认为多倍体化是新物种的形成机制之一，植物多倍化一直被认为是驱动物种进化的动力之一［6］，也是植物进化中最重要的事件之一［7］。同源多倍体的进化路径大致可以分为3 个阶段［8］。第一阶段，植物基因组在自然胁迫或人工干预下产生加倍效应。自然群体中很少出现自发加倍现象，因此多倍体植株在第一阶段主要通过人工合成获得，主要研究诱变的方法和效率；第二阶段，基因组加倍导致遗传和表观遗传学的改变，如促进结构和功能重组。在这一阶段，多倍体植株普遍表现出比原植株优越的农艺性状，如果实较大、较好的果味、较高的营养和生物活性成分含量，具有较高的抗生物和非生物胁迫能力。由于多倍体的优良特性，多倍体植物大多直接用于商业生产或作为中间材料生产优良的三倍体；第三阶段，多倍体植物虽然染色体数目未变，但期间同源染色体发生联会配对二倍体化（图1），产生新的物种，可能经过数千年甚至上万年。

图1 多倍体进化路径Fig.1 Evolutionary pathway of plant polyploidy

2 果树多倍体产生途径

2.1 果树天然多倍体

自然界中的植物多倍体大多由自然突变产生，一般由于植物生长环境发生改变或者遭遇极端环境，从而对基因组染色体产生影响，造成基因组加倍［1］，该事件被称为基因组复制事件。

果树中存在着大量的多倍体，全世界通过染色体鉴 定的果树 有36 科，70 属，800 余种，其 中多倍体类型约占总数的一半［9］。在苹果属植物中，有10 个种存在多倍体类型［10］。79 个西洋梨品种里，有18 个是三倍体［11］。李属植物72 个种里，有15 个是多倍体种［10］。

果树中同一物种中多倍体类型也存在着多样化，桃中研究发现［12-14］，存在三倍体、八倍体、十二倍体等；草莓中存在四倍体和五倍体类型［15］；梅中存在四倍体和二四嵌合体［16-17］；樱桃中，存在三倍体和四倍体；枣中存在三倍体和嵌合体［18-19］。

果树中多倍体类型大多来自于自然芽变，如平度大巴梨是巴梨的同源四倍体芽变新品种［20］，天海鸭梨是鸭梨的同源四倍体芽变新品种［21］，上海农科院在砂梨中发现了翠冠的天然四倍体［22］；郭文武［23］、汪卫星［24］分别从柑橘、枇杷中鉴定出了三倍体、四倍体以及混倍体。

2.2 人工诱变果树多倍体

人工诱变果树多倍体，是人类对果树生长进行干预，采取一定的处理手段，从而人为模拟极端环境变化，造成基因组或染色体产生加倍效应。

人工诱变分为在体诱变和离体诱变2 种类型［25］（图2）。在离体条件下，利用物理、化学、生物技术等手段对离体果树器官组织进行处理，从而获得多倍体材料。孙清荣等［9］将梨的试管组培苗置于γ-射线的照射下，再将产生的嫩芽进行继代培养3 次，获得了梨的四倍体材料；在组织培养条件下，利用不同的诱变剂浓度和曝光时间进行多倍体诱变，即可获得多倍体材料，枣［26］、葡萄［27］、香蕉［28］等果树上均有成功的报道。

图2 果树多倍体产生途径Fig.2 Pathway of polyploid generation in fruit trees

在体诱变，主要是对果树田间生长的树体器官进行诱变，比如王康等［29］利用二甲戊乐灵处理薄皮甜瓜幼苗茎尖生长点，成功获得四倍体薄皮甜瓜；蒋洪恩等［30］通过使用不同浓度的秋水仙素溶液涂抹新生枣头的方法，获得3 个枣品种的同源四倍体材料。

总体来说，离体诱变率高于在体诱变，主要原因是由于离体组织细胞多处于分生状态，诱变剂更易产生作用，同时离体诱变可以人工控制环境，减少人为因素对诱导材料的影响。但是，对于果树育种，离体诱变虽然诱变效率较高，但是育种周期较长，从组织培养到田间栽培继而产生经济效益，至少需3～10 年的时间。在体诱变在树体上直接诱变，产生的多倍体枝条可以进行嫁接，次年或第三年即可结果，极大缩短育种时间，但是在体诱变产生的嵌合体频率较高，对后期选择使用需要投入大量的人力物力。值得一提的是，河北农业大学中国枣研究中心发明了田间愈伤组织途径诱导枣多倍体技术［31］，该技术整合了离体诱变更易获得多倍体和田间树体生长速度快的优点，显著缩短枣育种周期，减少嵌合体产生，成功培育出多个枣多倍体品种。该技术在其他树种上同时取得成功，如酸枣［31］、榆树［25］等。

3 果树倍性鉴定

果树诱变后，需对诱变材料进行倍性鉴定，根据使用方法的不同，基本的测定方法主要包括染色体计数法鉴定、形态鉴定、流式细胞术鉴定和分子技术鉴定（图3）。

图3 果树多倍体主要鉴定方法Fig.3 Main identification methods of polyploid in fruit trees

3.1 形态鉴定

形态学鉴定是最直接、最简单的鉴定方法，果树多倍体普遍都表现出一定的“巨大性”，研究发现［32］，樱桃的四倍体植株与二倍体植株比较，其叶片变长变宽、叶片颜色加深、气孔变大、气孔密度变小。石庆华［25，33］研究发现，枣四倍体叶片变大、变厚、叶片颜色加深、叶缘褶皱、气孔变大、气孔密度变小。李林光研究苹果四倍体发现［34］，与二倍体相比，同样表现出节间变短、生长角度开张、果实变大等。基于上述结果，利用形态学进行多倍体材料的选择也被普遍接受，但是形态学鉴定适用于倍性较低的材料，当诱变材料是高倍性时，并不能准确的鉴定其倍性，因此，该方法多用于诱变材料的初步筛选。

3.2 染色体计数法鉴定

目前，染色体计数是最主要的倍性鉴定方法。鉴定对象为花粉母细胞或根尖细胞内的染色体。根据观察材料的不同，又可分为常规压片法和去壁低渗法。去壁低渗法在实际应用中较多，王娜等利用此方法对冬枣组培苗进行了染色体的观察，成功鉴定出了多倍体材料，在很多研究中发现［35-36］，染色体数随倍性的增加而增加。染色体计数鉴定是最准确的倍性鉴定方法，但是步骤繁琐，对测定材料和实验人员要求较高，工作量相对较大，不适宜进行规模化的倍性鉴定，同时染色体计数法对于二四嵌合体不能准确鉴定。

3.3 流式细胞术鉴定

流式细胞仪能在很短的时间内收集大量的细胞核并对其中的DNA 含量进行统计，其操作简单，准确性高且测定时间短，适用于大规模材料的倍性鉴定。近年来，普遍应用于植物材料的倍性鉴定。目前，在梨［37-38］、荔枝［39］、杏［40］等果树上均成功建立了流式细胞术鉴定倍性的方法。但是，流式细胞术测定之前条件的摸索需要花费一些时间，比如在材料选择、裂解液筛选、技术操作等方面［41］。研究发现同一物种，不同品种内基因组大小存在巨大的差异，因此进行倍性鉴定时，必须有对照，对无对照的植株无法准确检测出其倍性。

表1 主要果树多倍体研究进展列表Table 1 List of polyploid research progress of main fruit trees

3.4 分子标记技术鉴定

分子标记技术在果树倍性鉴定中具有重要作用。研究发现，AFLP 技术不仅准确的鉴定出枇杷三倍体和四倍体，同时还能鉴定到特定的片段变异［42］；RAPD 不仅可以鉴定出多倍体，还可鉴定出诱变材料是否是嵌合体，Kuniak Sugawara 等利用该技术鉴定了柑橘的嵌合体情况［43］；庞晓明等［44］利用24 对SSR 引物对新发现的疑似多倍体品种进行鉴定，3～9 个引物产生了3 个不同的等位基因，确定其倍性为三倍体；原位杂交GISH、FISH等技术在果树倍性鉴定中也发挥着重要作用，研究表明GISH 不仅可以鉴定倍性，还可以鉴定杂交信号［45］，其缺点是操作步骤较为繁琐，花费比较高昂。

3.5 综合倍性鉴定策略

随着育种技术的日臻成熟，果树多倍体创制已进入规模化时代，从大量的诱变材料中，快速的鉴定出多倍体材料已成为比较棘手的问题，利用上述的任一方法鉴定倍性，均存在的一定的局限性。因此，将上述方法进行综合的运用，才能从海量的诱变材料中，快速、准确的选出多倍体材料。郭文武等［46］利用形态鉴定、流式细胞仪、SSR 分子标记相结合的方法，实现了40 d 内对柑橘四倍体后代的精准发掘，准确率在80%以上。

4 多倍化对果树的影响

4.1 多倍化对果树表型性状的影响

果树多倍化后，不同倍性条件下，果树表型性状存在一定的差异。酸枣四倍体叶片均显著增大，但是八倍体叶片显著小于其对照，在田间条件下，四倍体枣和酸枣植株强壮，叶片变圆，叶色加深；而八倍体呈现变小的趋势，生长缓慢，叶片变小，节间极短，不能在田间长时间存活［47］。

果树多倍化后，由于物种的不同，不同的性状表现也有一定的差异［48］。果实方面，多倍体的果实一般都明显大于二倍体，在苹果［49］、甜瓜［50］、香蕉［51］、猕猴桃［52］、醋栗［53］、杨桃［54］等同源四倍体上均有报道。但是，在其他的物种上，也存在不同表现，在梨四倍体中，果实并不增大，但生长速度显著高于二倍体［22］。

多倍化对株高的影响表现为3 方面：（1）同源四倍体植株高度显著高于二倍体植株，有学者对香蕉同源四倍体研究发现［51］，四倍体香蕉高度明显高于二倍体，同时同源四倍体甘菊［55］、猕猴桃［52］、拟南芥［56］等植株高度均高于其二倍体；（2）同源四倍体植株高度显著低于二倍体植株，Manuel Blasco 等研究发现，四倍体枇杷高度明显低于其二倍体［57］，印度学者研究四倍体芸薹属植物发现［58］，四倍体植株较二倍体植株分别降低了20.62%、21.95%、18.9%、60.27%，日本学者研究四倍体橡胶树发现［59］，四倍体橡胶树较二倍体植株高度降低83.82%；（3）在生长初期，四倍体植株和生长速度明显低于二倍体，但是当果树进入稳定结果期后，果树生长恢复正常，四倍体高度与二倍体不存在明显差异。除上述情况外，有学者研究发现［58］，对同一植物进行同源加倍后，植株高度表现出不一致性，有的四倍体植株明显高于二倍体，而有的四倍体却明显低于二倍体，这说明同源加倍后，对植株高度的变化并不存在一致性。

4.2 多倍化对果树抗逆性的影响

相对于其二倍体，植物多倍体对外界环境生长环境的耐受力产生了重大改变，主要表现在抗寒性、抗旱性、抗病性和抗盐碱性等方面。植物四倍体基因组较二倍体增大了接近一倍，而较大的基因组在遭受外界环境的刺激下，基因组因为变大使植物的基因受到影响的概率降低，因而植物四倍体在严酷的自然条件下能更好的生长［60］。

果树四倍体相对于二倍体来说，其抗寒性主要表现为2 种：（1）同源四倍体的抗寒性增强，这是大部分同源四倍体的表现形式，汪泰初等［61］研究发现，桑树同源四倍体的抗寒性较二倍体明显提高；学者研究四倍体彩色马蹄莲发现［62-63］，游离脯氨酸含量、可溶性蛋白含量、POD 活性、SOD 活性均不同程度高于二倍体，综合指标断定其抗寒性提高；（2）果树四倍体抗寒性弱于二倍体，贾林光等［64］利用电导法和电阻抗图谱法研究四倍体苹果砧木发现，四倍体一年生枝条的半致死温度显著高于二倍体，因此同源四倍体砧木的抗寒性降低；王立新等［65］研究发现，在低温胁迫下，四倍体的形态表现明显弱于二倍体，四倍体冬枣耐寒能力明显低于二倍体；从上述可以推测，植物同源四倍体的抗寒性因物种的不同而不同。

果树多倍体具有较高的耐盐性，前人研究发现，四倍体苹果与其二倍体苹果在相同的盐处理条件下，四倍体苹果的生长形态较正常，同时水通道相关蛋白高水平表达，因此四倍体苹果具有更高的耐盐性［66-67］；薛浩等［66］研究四倍体苹果时发现，在盐胁迫下四倍体植株形态表现明显优于二倍体，叶片含水量高于二倍体，相关蛋白表达水平也表现出较高的水平；朱红菊等［68］研究四倍体西瓜幼苗根系发现，Na+和K+离子吸收转运变化及离子转运相关基因与二倍体存在差异表达，其耐盐能力明显高于其二倍体。

较多的研究表明，果树四倍体的抗旱性均明显高于二倍体，Zhang 等研究发现［69］，四倍体苹果的抗旱性强于二倍体，与二倍体相比，四倍体苹果的相对含水量和叶绿素荧光参数较高，丙二醛和脯氨酸水平较低，推断四倍体苹果耐旱性高于二倍体。

4.3 多倍化对果树育性的影响

植物多倍化后，由于染色体组的激增，减数分裂时造成染色体配对困难，从而产生不同程度配子的不育性，植物本身会进行新的功能分配，在此期间，植物早期大多表现出育性降低的特性［70］，同时因为树种的不同，其花粉育性也存在差异。天然四倍体枇杷育性明显低于其二倍体，在进行减数分裂时存在异常现象，在染色体配对过程中，除了主要的二价体，还会发现单价体和多价体［71］；在扫描电镜下观察发现，苹果四倍体花粉在形态上与二倍体不存在明显差异，但是苹果四倍体花粉畸形率明显高于二倍体［72］；张靖国等研究发现［73］，三倍体砂梨的花粉活力和自交结实率都为0，不具备育性能力。

综上，果树多倍化后，各种性状并不都呈现加倍效应，这就要求植物育种工作者深入研究植物的多倍化效应，探究多倍化后的分子机理，从而为特定果树的倍性育种及多倍体种质的合理利用提供理论指导。

4.4 多倍化对组学水平的影响

4.4.1 基因组水平

植物多倍化后，最直接的变化是基因组变大。在前人诱变研究中，四倍体基因组较二倍体品种增大约2 倍。而植物染色体加倍后，基因组产生的具体变化越来越成为研究的热点之一。基因组重组是植物染色体加倍后的必要阶段，由于基因组加倍后基因组突然增大，植物本身必须通过自身的调节机制对基因组进行重组，以减少大基因组对植物本身造成的压力，平衡不同基因组组分、核基因、细胞质基因组之间的相互关系，达到最大相容性，保持植物体的正常生长。

据报道，植物多倍化后，植物基因组会发生DNA 甲基化、DNA 基因序列消除、染色体结构重组等变化。植物染色体加倍后，会对基因组的遗传结构产生重大影响，这在其他林木上也有了许多报道，程甜甜等［74］研究四倍体青檀发现，同源四倍体青檀与其二倍体在遗传结构上存在很大不同，其DAN 多态性小于其二倍体，但是其单株遗传距离在总体水平上略高于二倍体；李雅婷等［75］研究发现，与二倍体相比，同源四倍体甜叶菊在AFLP 水平上存在很大的不同；柴俊雯等［76］利用ISSR 分子标记技术对同源四倍体黄芩及其二倍体进行比较发现，在ISSR 水平上，两者存在很大的遗传差异。

研究表明，基因组加倍后，植物表观遗传调控模式会产生较大的变化，最突出的变化体现在全基因组甲基化上，MSAP 分析表明四倍体猕猴桃四倍体的甲基化率低于二倍体［77］；彭滢等［78］等以二倍体枳橙为对照，利用MSAP 分子标记对四倍体枳橙叶片的甲基化水平和模式变化进行分析发现，全甲基化率明显高于其二倍体，四倍体总甲基化率变化较小，半甲基化率有所下降，相对其二倍体，四倍体变化集中在模式变化上；杨炳艳等［79］通过22 对MSAP 引物扩增得到1564 个位点，在低温条件下，四倍体西瓜总甲基化率显著低于其二倍体。

4.4.2 转录组水平

植物四倍体的新基因组中存在大量的重复基因和冗余基因［80］，一般情况下，这些基因有3 种不同的表达模式：（1）重复基因正常表达，保持与二倍体植物基因组相同或者相似的基因功能；（2）重复基因沉默［81-83］，不执行基因功能，原因是由于同源四倍体基因组胞嘧啶甲基化状态产生变化或者染色体遗传结构的改变；（3）重复基因重新分化执行新的基因功能，可能是由于基因组的改变，使某些基因产生了脱甲基化，从而使原本沉默的基因重新激活，同时也会激活一部分反转座子、蛋白序列或者未知功能序列［83］。

转录组测序（RNA-seq）是研究植物基因表达情况的重要手段之一，一般的过程是，提取植物总RNA 后，富集出mRNA，进而反转录成cDNA，从而对cDNA 进行测序分析。该技术可以揭示细胞和组织在不同生长阶段或不同生长条件下转录本的结构和数量，为基因结构及表达提供信息，有助于阐明特定生物学和疾病过程中的分子机制。随着转录组测序技术的日臻成熟，植物四倍体与其二倍体的转录组分析也日渐增多。

Saminathan 等［84］研究四倍体 西 瓜 时 发 现，与二倍体相比，鉴定了四倍体中分别上调和下调的5362 和1288 个基因，进一步研究发现精氨酸生物合成、叶绿素合成、GDP 甘露糖生物合成、海藻糖生物合成以及淀粉和蔗糖降解途径的基因在四倍体中明显上调，22 个基因在组织中经历可变剪接（AS，Alternative Splicing）事件；王立新等研究发现［65］，4 ℃条件下四倍体冬枣抗寒性显著低于二倍体，比较转录组分析表明，二倍体在冷暴露后6 h和24 h 分别表达了56 和694 个差异表达基因（DEGs），而同源四倍体样品在6 h（225）和24 h（2774）时差异表达基因的数量增加，根据GO 注释分析，DEGs 分为不同的功能组，包括催化活性、结合和转运活性、代谢途径、细胞过程和对刺激的反应，结合冷反应相关基因发现，微管在CML41 和IQD1 的表达中发挥着至关重要的作用；Li 等研究发现［77］，二倍体和四倍体猕猴桃之间共有2230 个差异表达基因，其中下调660 个，上调1570 个。DEGs 主要是与植物生长发育、抗逆性和抗菌能力有关的基因；Zhu 等［85］转录组分析揭示了二倍体和四倍体猕猴桃之间有5922 个差异表达基因，GO富集发现，差异基因中包括果胶甲酯酶（PMEs）和扩展蛋白（EXPs），这2 种基因在细胞壁松动和延伸中都起着关键作用，PME 和EXP 基因表达的增加可能有助于四倍体植物中细胞大小的增加。

4.4.3 蛋白组水平

蛋白质组学最早的提出者是澳大利亚学者威尔金斯和威廉姆斯，他们于1994 年在意大利召开的一次科学会议上提出，蛋白质组是指由某个基因组，或细胞、组织表达的所有蛋白质［86］，蛋白组学研究的目的是对蛋白质产生的原因及过程进行必要的解释。随着多种植物的基因组测序完成和基因组研究的深入，植物蛋白质组学已经成为当今后基因组学的重要研究课题之一。

目前，在果树上对四倍体的蛋白组研究还鲜有报道，但在其他林木上有一定的报道，Wang等［87］研究泡桐及其同源四倍体，共鉴定和定量了3010 个蛋白，其中差异显著蛋白773 个，其中上调表达410 个，下调表达363 个。在同源四倍体泡桐中，细胞分裂、谷胱甘肽- 1 代谢、纤维素、叶绿素和木质素的合成相关蛋白富集显著。

曹亚兵等［88］利用同位素相对标记与绝对定量技术，研究了盐胁迫后同源四倍体白花泡桐及其二倍体响应盐胁迫的蛋白质组变化，从293 个差异蛋白质种选取了32 个差异蛋白质，这32 个差异蛋白质都是与倍性相关的盐应答蛋白质；32 个差异蛋白代谢通路（KEGG pathway）富集结果发现，这些差异蛋白主要参与了光合作用、淀粉、糖等代谢过程；同时发现了3 个可能是潜在的盐应答蛋白质，分别是过氧化物酶、2-酮戊二酸脱氢酶E1 和氢离子转运ATP 合酶。

5 存在问题

5.1 嵌合体现象仍普遍存在

嵌合体是指具有2 种或2 种以上遗传组成的植株。随着诱变技术的提高，多倍体诱变育种已经进入规模化创制时代，但是嵌合体的现象仍然存在且占据一定的比例。石庆华等［47］和作者前期在进行枣育种诱变时，无论对诱变条件进行何种优化，均产生了一定量的二四嵌合体。

在实际生产中，嵌合体不能直接应用于生产，植株会根据自身的适应性逐渐淘汰掉占劣势的多倍体细胞，逐渐回复成二倍体。蒋洪恩［87］在田间条件下采用修剪法对枣树嵌合体进行纯化，即在新生枣头生长过程中不断剪除未变异枝条，费时费力。

由于处理时无论在体诱变还是离体诱变均为多细胞体，又因有丝分裂细胞的不同步性，所以得到的诱变材料绝大部分都含嵌合体。消除嵌合最主要的方法是自交，这样会得到一大批各种不同遗传型的植株，而选择合适的个体不仅困难、而且费时，因此嵌合体的纯化问题需要进一步优化完善。

5.2 诱变剂的毒害问题突出

秋水仙素目前是最常用的诱变剂［89］，但是其价格昂贵且具有一定的毒性。对在体植物进行诱变时，稍高的浓度就会造成植株长势衰弱甚至死亡；组织培养时，诱变剂会抑制不定芽的分化，再生植物生长速度减缓，因此寻找一种价格低廉、毒性小和诱变效果好的诱变剂，是以后要解决的问题之一。

6 结语

随着诱变技术的不断改进和日臻成熟，果树多倍体育种将迎来新的飞跃，进入规模化创制时代，今后利用基因组辅助育种和分子设计精准育种将会成为新的发展趋势。

另外，多倍化对果树的影响多样，这种差异的产生的原因目前仅停留在表型和生理生化水平的研究上，进一步的分子机理研究较少。因此，果树多倍化后表型性状的分子形成机理会逐渐成为研究的重点和热点，为多倍体资源开发与利用提供基础理论支撑。