细胞蜡块在浆膜腔积液性淋巴瘤诊断中的应用价值

梁储财，邵少慰

20%～30%淋巴瘤患者可出现浆膜腔积液。浆膜腔积液是淋巴瘤较常见的并发症，以胸腔积液最多见，其次是腹腔和心包腔积液[1]。浆膜腔积液性淋巴瘤的细胞学诊断及病理分型是细胞病理学的难题，如何通过对细胞形态学的观察寻找提示淋巴瘤的线索，选择相应的辅助技术进行诊断与鉴别诊断，是病理医师经常遇见的问题。本文收集13例浆膜腔积液性淋巴瘤，对其细胞蜡块切片行HE、免疫细胞化学染色，以及部分病例行染色体核型分析、基因重排检测及流式细胞学检查等，探讨浆膜腔积液性淋巴瘤的临床病理学特征、诊断、鉴别诊断及细胞蜡块的临床应用价值。

1 材料与方法

1.1 临床资料收集2015年8月～2019年8月肇庆市第二人民医院存档的13例浆膜腔积液性淋巴瘤，其中男性10例，女性3例，年龄36～85岁，中位年龄59岁。其中胸腔积液8例，腹腔积液4例，心包腔积液1例(表1)。

表1 13例浆膜腔积液性淋巴瘤的临床病理学特征

1.2 方法

1.2.1细胞蜡块切片 收集新鲜浆膜腔积液标本100～200 mL，标本静置10 min，弃去上清液，取标本瓶底部约100 mL液体震荡摇匀，倒入2支50 mL离心管，2 000 r/min离心10 min，弃去上清液，将2管沉淀物移至另一支离心管中，分别加入几滴麝香草酚蛋清液和10%中性福尔马林10 mL并摇匀，2 000 r/min离心5 min，弃去上清液后，剔出沉淀物用擦镜纸包裹放进脱水盒，常规脱水、浸蜡，包埋、切片，HE染色，余细胞蜡块用作后续免疫细胞化学染色、EBER原位杂交、免疫球蛋白基因重排及染色体核型分析等检测。

1.2.2免疫细胞化学染色及EBER原位杂交 免疫细胞化学染色采用SP法，一抗CK、CD45、CD20、CD79a、CD3、CD5、Ki-67、PAX5、MUM-1、CD10、TDT、BCL-2、BCL-6、CD99、CD23、CD30、CD138、Cyclin D1、MPO等，均购自广州安必平公司，EBER原位杂交试剂购自北京中杉金桥公司。操作步骤严格按照试剂盒说明书进行，并设阴、阳性对照。

1.2.3分子遗传学检测 13例标本中有10例进行了分子检测，其中6例送广州安必平公司行细胞蜡块切片染色体核型分析；其余4例送广州金域检验中心，1例行细胞蜡块切片免疫球蛋白基因重排，3例行外周血流式细胞学检查。

1.3 结果判断所有病例的细胞学涂片及细胞蜡块切片均由2位高年资病理医师阅片，依据镜下不成熟淋巴细胞或淋巴样细胞是否占优势，作出淋巴细胞良、恶性的初步评价和分类(如大/小细胞性)，随后参照是否已有活检组织学确诊，选取相应抗体和EBER原位杂交进行标记，协助进行淋巴瘤亚型分类。

2 结果

2.1 细胞学诊断与组织学诊断的符合度13例浆膜腔积液性淋巴瘤免疫细胞化学染色均符合非霍奇金淋巴瘤，其中12例为弥漫大B细胞淋巴瘤(diffuse large B cell lymphoma, DLBCL)，1例为T淋巴母细胞淋巴瘤(T lymphoblastic lymphoma, TLBL)。13例均有对应的组织学诊断结果，其中10例取颈部/腋窝淋巴结活检，7例为DLBCL生发中心型(germinal center type, GCB)，3例为DLBCL非生发中心型(non-germinal central type, non-GCB)；小肠占位及胸膜病变各1例，活检组织学诊断均为DLBCL,GCB型；纵隔包块1例，活检组织学诊断为TLBL。本组13例浆膜腔积液性淋巴瘤细胞学诊断与组织学诊断结果基本一致(表1)。

2.2 病理特征及免疫表型12例DLBCL浆膜腔积液细胞蜡块切片：镜下均见中等偏大的淋巴样细胞弥漫分布，核圆形或卵圆形，染色质粗糙，可见1个或多个核仁，核分裂象易见(图1)。免疫表型：CD45、CD79a、CD20(图2)均弥漫阳性，Ki-67增殖指数平均值为75%，TDT、CD99、BCL-2、CD3、CD5、CK及EBER原位杂交均阴性，同时行CD10(图3)、BCL-6和MUM-1染色，提示9例为GCB型，3例为non-GCB型。1例TLBL浆膜腔积液细胞蜡块切片：镜下可见体积增大的淋巴样细胞，核染色质粉尘状，核圆形，见小核仁，胞质少，凋亡小体易见(图4)。免疫表型：CD3(图5)、CD5、CD99和TDT(图6)均阳性，Ki-67增殖指数为70%，CD20、PAX5、CD45、CD79a、CK阴性(表2)。

①②③④⑤⑥⑦⑧

表2 13例浆膜腔积液性淋巴瘤细胞蜡块免疫细胞化学、EBER原位杂交及分子检查结果

2.3 分子检测13例中有10例行分子检测，其中2例细胞蜡块染色体核型检测见3、7、17号染色体扩增(图7)，p16基因缺失(图8)，4例细胞蜡块染色体核型检测阴性，1例细胞蜡块免疫球蛋白基因重排(+)；2例外周血流式细胞学见异常B肿瘤细胞，1例外周血流式细胞学符合急性T淋巴细胞白血病/TLBL(表2)。

3 讨论

浆膜腔积液是淋巴瘤(淋巴细胞性白血病)常见而凶险的并发症，其发生机制主要是由肿瘤细胞转移或侵犯浆膜、阻塞胸导管，淋巴液引流受阻，或继发感染所致[2]。浆膜腔积液性淋巴瘤以非霍奇金淋巴瘤多见，早期CT及胸部X线检查均不易发现[3-4]。陈晓华等[5]报道，浆膜腔积液性淋巴瘤B细胞起源比T细胞起源更常见，其中B细胞淋巴瘤以DLBCL为主。本组13例浆膜腔积液性淋巴瘤包括12例DLBCL和1例TLBL，以B细胞起源为主，与文献报道相符。

3.1 诊断淋巴瘤的早期症状多表现为颈部、腋窝、腹股沟等部位进行性、无痛性淋巴结肿大，部分还伴有发热、消瘦、瘙痒、盗汗等全身表现，晚期还会出现肿瘤侵犯不同组织器官的相应临床症状。浆膜腔积液则是淋巴瘤病变发展过程中一种凶险的伴随症状，预后差。本组13例中，10例首发症状是浅表淋巴结肿大，1例发现小肠占位，1例发现纵隔占位，1例出现胸膜病变。13例患者除2例拒绝治疗和1例失访，其余10例均进行化疗并获得随访，仅2例分别随访22个月及18个月仍存活，其余患者均在数月内死亡。

淋巴瘤性浆膜腔积液多呈血性、黄色浑浊状或乳糜样。镜下可见不成熟淋巴样细胞，其成分单一，细胞黏附性差，无明显成团、成簇现象，细胞胞质少，核质比高，呈裸核状。核类圆形或不规则，染色质呈颗粒状，易见核分裂象、核碎裂及凋亡小体[6]。因此，在浆膜腔积液细胞学镜检中出现上述形态学特征的，要高度考虑淋巴瘤的可能性[7-10]。对于组织学诊断在细胞学诊断之前，细胞学诊断可参照组织学诊断，只要合理选取免疫抗体进行检测验证即可明确诊断。而对于细胞学检查时尚未有明确组织学诊断支持，则需行免疫细胞化学分步检测，甚至要借助分子遗传学检测手段来辅助进行细胞学诊断及分型。本组13例中有5例组织学诊断在细胞学诊断之后，故需应用细胞蜡块切片免疫细胞化学分步检测协助诊断及分型。

部分浆膜腔积液性淋巴瘤仅依靠细胞形态学及免疫表型仍难以明确诊断及分型，而分子遗传学诊断技术具有特异性高、准确率高、步骤简便、快速等优势，在淋巴瘤中应用越来越广泛。许多淋巴瘤细胞有克隆性基因重排及染色体异常改变，常见的相关基因有IgH基因重排、t(1；14)易位、原癌基因TP53、BCL-2、MYC突变、API2-MALT1融合基因、NPM/ALK融合基因、6q缺失、染色体数目畸变等，因此可通过上述分子诊断技术对浆膜腔积液性淋巴瘤进行辅助诊断及分型[11]。本组13例中7例因未及时取得病理活检或穿刺活检中肿瘤细胞量少难以满足分子检测要求，故选取了肿瘤细胞丰富的细胞蜡块作为分子检材，其中6例行染色体核型分析，2例呈阳性，4例呈阴性，阳性率为33.3%；1例行免疫球蛋白基因重排呈阳性。

用浆膜腔积液制作细胞蜡块，能收集到比传统细胞涂片更丰富的细胞量，切片的细胞形态更清晰，能保留一定的组织结构，背景干净，更利于镜下观察；更重要的是，细胞蜡块可以多次切取，以便进行免疫细胞化学染色等后续检查，可更好地帮助判断肿瘤的组织起源和病理学亚型[11-12]。

3.2 鉴别诊断(1)淋巴细胞反应性增生：如结核病等慢性疾病或病毒感染等患者浆膜腔积液中可出现大量小淋巴细胞，其形态较一致，易与小细胞型淋巴瘤混淆；但这些小淋巴细胞表现成熟且明显夹杂有其它炎症细胞，TDT和B淋巴细胞标记均呈阴性，行基因重排提示淋巴细胞为多克隆性。(2)转移性低分化或未分化癌：其癌细胞核质比高，核大小不一、深染，部分核偏位，呈印戒状，细胞体积多为成熟淋巴细胞的2倍及以上，易与大细胞型淋巴瘤混淆；但此类癌细胞多成团成簇脱落，其异型性程度比淋巴瘤细胞更高，免疫细胞化学染色CK阳性，CD45阴性。(3)小圆细胞恶性肿瘤：如神经母细胞瘤、原始神经外胚层肿瘤(primitive neuroectodermal tumor, PNET)/尤因肉瘤、肺小细胞癌等。该类肿瘤影像学往往提示相应部位占位或包块，也可引起浆膜腔积液，镜检见异形性细胞密集排列，细胞核深染，核质比高，核染色质均匀，核仁不明显，部分可形成菊形团等特殊结构[13]，故需与淋巴瘤细胞出现的假菊形团结构鉴别，免疫细胞化学染色CD45均阴性，CD56、Syn和CgA阳性。

综上，应用细胞蜡块结合免疫细胞化学染色，以及染色体核型分析、基因重排检测等分子遗传学技术，对浆膜腔积液性淋巴瘤进行诊断及病理分型，不仅能为肿瘤精准治疗提供依据，而且对评价治疗效果及判断预后也具有一定的临床应用价值，尤其是当患者无法获得满意的组织病理活检标本时更为重要。