基于流式细胞术的爪耳木染色体倍性与基因组大小测定

李英英 刘咲頔 王清隆* 王 鹏 王祝年

（1中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所，海南海口571101；2中国热带农业科学院海口实验站，海南海口 571101）

爪耳木（Lepisanthesunilocularis）为无患子科（Sapindaceae）鳞花木属（Lepisanthes）常绿灌木[1]，为国家二级重点保护野生植物和海南特有灭绝级植物[2-3]。1935年爪耳木消失在人们视野，2013年人们再次发现爪耳木身影，时间跨度近80年[4]。爪耳木耐旱、耐瘠薄，是海南热带滨海植被中为数甚少的乔木树种之一，是海南滨海地区较理想的造林树种[5]。爪耳木根可入药，具有一定的药用和经济价值[6]。目前，关于爪耳木基因组学的研究鲜报道，这导致爪耳木的研究和利用受到制约。

流式细胞术是利用流式细胞仪进行的一种单细胞定量分析和分选技术。流式细胞术是单克隆抗体及免疫细胞化学技术、激光和电子计算机科学等高度发展及综合利用的高技术产物[7]，是测定基因组大小的常用方法。目前，流式细胞术已应用在芭蕉、旱柳、玫瑰茄、红麻等植物基因组大小测定上[8-11]。本研究利用流式细胞术对爪耳木进行染色体倍性测定和基因组大小评估，以期为爪耳木的基因组学研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

用于流式细胞术分析的爪耳木叶片采自中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所农业部儋州热带药用植物种质资源圃（东经 109°50′09″、北纬19°51′09″），叶片采摘后置于 4 ℃冰箱中保存。

内参植物选择橡胶7-33-97和大豆williams82的新鲜叶片，橡胶7-33-97采于海南儋州橡胶种植圃，基因组大小为1.46 GB[12]；大豆williams82由中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所提供，基因组大小1.12 GB[13]。橡胶新鲜叶片采摘后存于4℃冰箱；大豆williams82为种子苗，置于光照培养箱中培养。

1.2 试验药品与仪器

供试药品：PI溶液20 mg/L、DAPI溶液 20 mg/L、WPB解离液、GLB解离液等。

供试仪器：流式细胞仪、培养皿、镊子、刀片、漏斗、试管等。

1.3 试验方法

本试验用爪耳木初生叶、幼叶、成叶以及橡胶7-33-97嫩叶、大豆williams82嫩叶，用流水反复冲洗3～5次，每次30 s，将叶片表面完全洗净后用卫生纸擦干，留待试验取用。分别用WPB解离液和GLB解离液解离这些叶片，筛选合适的解离液。使用DAPI溶液20 mg/L染色，利用流式细胞仪在UV光线下检测基因组倍性。使用PI溶液20 mg/L染色，利用流式细胞仪在632 nm频率下检测基因组大小。

1.3.1 爪耳木染色体倍性检测。①取材：取指甲盖大小的爪耳木初生叶、幼叶、成叶及橡胶嫩叶、大豆嫩叶分别置于培养皿中，培养皿放在冰袋上。②解离：在培养皿中分别加入WPB解离液500～800 μL和GLB解离液500～800 μL，以稍微浸没叶片为宜，用刀片垂直将叶片切碎，让叶片碎片充分浸没在解离液中。③染色：提前将DAPI染液2 mL加入试管中，将解离2～3 min后的样品连同解离液通过漏斗分别加入试管中，将试管置于避光处染色20 min。④上机：上机前充分吹打混匀试管，激光选择UV档位，调整参照植物大豆样品峰的位置，位置确定后保持各项设置不变，暂停程序后更换待测样本，检测待测样本的样品峰位置，以此计算出待测植物的倍性（待测植物倍性=待测植物样品峰位置/参照植物样品峰位置×参照植物倍性）。每次更换待测样本前用超纯水清洗机器。⑤数据选择和保存：调整参照植物样品峰位置。检测完毕后用专用清洗液清洗，清洗后关机。

1.3.2 爪耳木基因组大小检测。①取材：取指甲盖大小的爪耳木初生叶、幼叶、成叶及橡胶嫩叶、大豆嫩叶分别置于培养皿中，培养皿放在冰袋上。②解离：在培养皿中分别加入WPB解离液500～800 μL和GLB解离液500～800 μL，以微微浸没叶片为宜，用刀片垂直将叶片切碎，让叶片的碎片充分浸没在解离液中。③染色：提前在试管中加入PI染液2 mL，将解离2～3 min后的样品连同解离液通过漏斗分别加入试管中，将试管置于避光处染色20 min。④上机：上机前充分吹打混匀试管，激光选择632 nm波长。检测参照植物，待出现明显的样品峰后通过调整电压等方式调整样品峰在横坐标上的位置，确定好位置后保持设定不变，暂停程序后更换待测样本，计算基因组大小（待测植物基因组大小=待测植物样品峰位置/参照植物样品峰位置×参照植物基因组大小）。每次更换待测样本前用超纯水清洗机器。⑤数据选择和保存：框选样品峰，将变异系数控制在5%以下，待检测到的具有荧光信号的细胞核超过2 000个后，可暂停程序，保存数据。检测完毕后用专用的清洗液清洗，清洗后关机。

2 结果与分析

2.1 爪耳木染色体倍性分析

通过调整流式细胞仪的设置，使大豆williams82样品峰的位置稳定在横坐标上四格的位置（图1），待样品峰基本稳定后，暂停程序，保持设定不变，用超纯水清洗上样口。之后上机爪耳木的待测样本，结果见图2。爪耳木的样品峰位置与对照样品大豆williams82的位置十分接近。大豆williams82为二倍体，因而推测爪耳木基因组倍性与大豆williams82相同，也为二倍体。

2.2 爪耳木基因组大小鉴定

图3为大豆williams82的PI荧光强度分布情况。于流式细胞仪上框选明显的样品峰，取具有荧光的细胞核数超过2 000个、变异系数低于5%的数据，以此保证数据的准确性。大豆平均值为17 012.71，变异系数为4.2%。图4为橡胶7-33-97的PI荧光强度分布情况，框选的样品峰平均值为21 472.6，变异系数为3.42%。图5为爪耳木的PI荧光强度分布情况，样品峰平均值为13 765.81，变异系数为4.42%。

依据大豆williams82基因组大小为1.12 GB，预测爪耳木基因组大小为906.24 Mb；依据橡胶7-33-97的基因组大小为1.46 GB，预测爪耳木基因组大小为935.99 Mb。因此，以大豆williams82和橡胶7-33-97作为参照的爪耳木基因组大小约为921.11 Mb。

3 结论与讨论

基于流式细胞术的染色体倍性和基因组大小测定结果表明，爪耳木为二倍体植物，基因组大小约为921.11 Mb。较高的重复序列比例和较低的杂合率说明爪耳木在基因型颇为偏向纯合的同时也有不小的突变概率。由于爪耳木为极小种群，种群内基因频率较低，加之本身基因型偏向纯合，一旦在遗传发育过程中发生基因突变或沉默、缺失，爪耳木就很难恢复到之前的状态，这也可能是之前爪耳木濒临灭绝的直接原因。