3 类辣椒对鲊广椒细菌类群和品质的影响

席 啦，熊英梅，王玉荣，侯强川，王 婷，杨 莹，郭 壮,

（1.湖北文理学院湖北省食品配料工程技术研究中心，湖北襄阳 441053；2.湖北文理学院乳酸菌生物技术与工程襄阳市重点实验室，湖北襄阳 441053；3.襄阳市公共检验检测中心，湖北襄阳 441001）

鲊广椒通常以辣椒和玉米或大米为主要原料，以食盐和香辛料为辅料，于倒扣陶瓷罐中密封发酵30 d 以上制作而成，在我国湖北省、湖南省、贵州省、四川省、陕西省和重庆市的部分地区具有较为广泛的食用人群。因采用厌氧发酵，鲊广椒口感酸爽且富含乳酸菌，其中乳酸杆菌（）的含量可以占到细菌总量的70%以上。我国华中和西南地区人群具有“嗜辣”的饮食特点，作为鲊广椒的“灵魂”，辣椒对鲊广椒品质的形成起到了重要作用。本团队前期研究发现，辣椒表面附着的微生物种类可能对鲊广椒发酵体系中微生物类群产生重要影响，例如若辣椒出现了腐败的情况则鲊广椒中青枯菌属（）的含量就会明显偏高。我国辣椒品种繁多，不同品种的辣椒辣度存在较大的差异，如小米椒（Linn.）、二荆条辣椒（L.）和菜椒（L.var（L.）Sendt.）的辣度分别在30000～50000 SHU、5000～15000 SHU 和500～1000 SHU，且辣椒自身含有的辣椒素等物质具有抑菌作用，可能对鲊广椒发酵体系中部分微生物菌株起到抑制作用。近年来，国内外学者通过揭示微生物群落结构与发酵食品品质的关联性，对发酵食品中关键微生物类群进行了甄别，证明了通过影响发酵体系的菌群结构，制作工艺、原材料和制作环境等因素均会对发酵食品的品质产生影响。本团队前期研究亦表明鲊广椒细菌群落结构和产品品质均受到地域、大米和玉米添加比例及是否添加外源乳酸菌菌株等多方面因素的影响，而关于辣椒种类是否会对鲊广椒细菌群落结构及其品质产生影响的研究报道尚少。

滋味和风味作为食物品质评价的重要指标，其相对强度的大小直接影响着食品品质的好坏。质谱类技术的迅速发展为解析食物中的组分提供了有效的手段，其能对食物中各种标志物进行甄别，但由于样品的前处理和分析过程较为复杂、一次甄别的标志物过多和不同化合物之间的相互影响，其并不能准确的评价食品的整体品质；而电子舌和电子鼻作为一种新出现的仿生技术，其对样品的滋味和风味具有整体选择性，不仅解决了各类呈味物质相互作用的问题，还排除了人为因素和实验操作带来的影响，在食品品质的评价上具有不可比拟的优势。

本研究以小米椒、二荆条和菜椒等3 种辣度不同的辣椒为试验组，同时设置不添加任何蔬菜和只添加芹菜（var.）的2 个对照组，以玉米为主要原料，通过自然发酵分别进行了鲊广椒的制备。在使用电子舌和电子鼻对鲊广椒品质进行评价的基础上，进一步采用MiSeq 测序技术对鲊广椒中细菌类群进行了解析，采用多元统计学方法对鲊广椒的优势菌属和品质指标之间的相关性进行了揭示，以期为鲊广椒这一特色发酵食品的产业化推动提供数据支撑。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

白胡椒 上海味好美食品有限公司；花椒 滕州滋正食品有限公司；食盐 江苏井神盐化股份有限公司；玉米糁、小米椒、二荆条辣椒、菜椒和芹菜市售；引物338F/806R 武汉天一辉远生物科技有限公司合成；FastPfu Fly DNA 聚合酶、dNTPs Mix 和10×PCR buffer 北京全式金生物技术有限公司；QIAGEN DNeasy mericon Food Kit DNA 基因组提取试剂盒 德国QIAGEN 公司；氯化钠（分析纯）天津市致远化学试剂有限公司；阴阳离子溶液、味觉标准液和参比溶液 日本INSENT 公司。

LC-LX-HRF250E 高速冷冻离心机 上海力辰仪器科技有限公司；SA 402B 电子舌 日本Insent 公司；PEN3 电子鼻 德国Airsense 公司；Illumina MiSeq高通量测序平台 美国Illumina 公司；UVPCDS8000凝胶成像分析系统 美国Protein Simple 公司；ND-2000C 微量紫外分光光度计 美国Nano Drop 公司。

1.2 实验方法

1.2.1 鲊广椒样本的制备 分别称取玉米糁375 g、白胡椒1.58 g、花椒1.58 g 和食盐18.75 g 各5 份，混合搅拌均匀备用，准备5 份，编号为A1～A5。其中，A1～A4 分别称取剁碎后的小米椒、二荆条、菜椒和芹菜各113 g，再次搅拌均匀后装入泡菜坛中，并在坛口均匀喷洒4 mL 白酒封口，置于20 ℃恒温密封发酵30 d。A5 除不添加任何蔬菜外，其他制作流程和A1～A4 相同。

1.2.2 鲊广椒滋味指标的测定 准确称取30 g 鲊广椒和70 g 蒸馏水搅拌均匀后10000 r/min 离心5 min，取上清液使用快速滤纸过滤后于4 ℃静置12 h 后，吸取上清液储存于测试杯中备用。参照张逸舒等的测试参数进行设置，每份鲊广椒样本平行测定4 次，取后3 次测试数据为本研究的数据。

1.2.3 鲊广椒风味指标的测定 准确称取20 g 鲊广椒存于样品瓶中，50 ℃水浴加热20 min，置于室温平衡20 min 后进行风味品质的测定。电子鼻测试参数参照尚雪娇等的方法进行设置，每份样本重复测试3 次，测试时间为90 s，响应曲线在45 s 后达到稳定，取59、60 和61 s 响应值的平均值构建电子鼻数据矩阵用于后续的数据分析。

1.2.4 宏基因组DNA 提取和扩增 称取3 g 左右的鲊广椒样本，使用试剂盒进行微生物DNA 提取，对提取的DNA 产物质量进行检测。以16S rRNA V3～V4 序列为靶点，将检验合格的DNA 进行PCR 扩增，具体扩增参数参照王玉荣等的方法进行设置。使用1.0%的琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计对DNA 扩增产物的纯度和浓度进行检验，并将检验合格的DNA 扩增产物送至上海美吉生物医药科技有限公司进行测序。

1.2.5 生物信息学分析 将下机的原始序列依据双端序列的重叠关系进行拼接，并依照标签信息对拼接后的序列进行归并和质控。使用QIIME（v1.70）平台，参照Yang 等对干酪中细菌多样性的分析流程，对样本细菌多样性和物种构成进行解析。主要步骤如下：a.使用PyNAST 软件对质控后的测序序列进行校准和比对；b.分别按照100%和97%的相似度进行序列划分，构建操作分类单元（Operational taxonomic units，OTU），并使用ChimeraSlayer软件对OTU 中的嵌合体序列进行识别和删除；c.对OTU 代表性序列的分类学地位注释和微生物多样性计算。

1.3 数据处理

基于电子舌和电子鼻数据使用PAST 软件对产品品质进行聚类分析；使用普氏分析（Procurstes analysis）对鲊广椒菌群和品质进行共变化分析；使用Pearson 相关性分析和威尔科克森检验（Wilcoxon Test）对优势细菌属（平均相对含量大于1.00%）与品质指标之间的相关性及显著性进行分析，并使用热图（heatmap）进行数据的可视化。使用R 软件和Origin 2017b 软件进行分析和绘图。

2 结果与分析

2.1 3 类辣椒制作鲊广椒中细菌多样性的解析

本研究按100%和97%划分OTU，并去除15个嵌合体OTU 后共得到3142 个OTU，每个样本的平均OTU 数为628。三类辣椒制作鲊广椒细菌16S rRNA 测序结果和多样性分析结果如表1 所示。

由表1 可知，不添加蔬菜制作的鲊广椒细菌群系辛普森指数最低，而添加芹菜或菜椒制作的鲊广椒超1 指数和辛普森指数普遍较高。超1 指数和辛普森指数常被用来对样本中的物种丰度和多样性进行评价。由此可见，在制作鲊广椒时添加蔬菜的种类可能会对鲊广椒发酵过程中微生物的群系产生影响。较之空白组，添加芹菜、菜椒和二荆条的鲊广椒其细菌群系的多样性和丰度均较高，究其原因可能在于蔬菜的添加一方面增加了鲊广椒的含水量，另一方面蔬菜表面携带的微生物可能也参与了鲊广椒的发酵。由表1 可知，添加小米椒制作的鲊广椒超1 指数最低，原因可能在于小米椒辣度在30000～50000 SHU，其含有的抑菌物质在一定程度抑制了发酵体系中细菌的生长和繁殖。

表1 不同样本细菌16S rRNA 测序结果和α 多样性分析Table 1 16S rRNA sequencing results and α diversity analysis in different samples

进一步分析发现，5 类样本共鉴定到46 个细菌属，3 类辣椒制作鲊广椒中相对含量大于1.00%优势细菌属的比较分析如图1 所示。

由图1 可知，添加二荆条和菜椒制作的鲊广椒主要以为主，其平均相对含量分别为77.53%和94.41%。本团队前期研究发现湖北省宜昌市当阳地区以二荆条辣椒和大米为主要原料制作的鲊广椒亦以为主，这与本研究的结果一致，进一步采用单分子实时测序技术在“种水平”上对当阳地区样品分析发现，其中的主要由破布子乳杆菌（）、食品乳杆菌（）和副短乳杆菌（）构成。值得一提的是，添加芹菜制作的鲊广椒亦以为主，其平均相对含量为94.49%。Deshpande等和Pérez-Díaz 等的研究指出，发酵果蔬制品中的乳酸菌主要来源于果蔬样品本身，其通过附着在果蔬的表面进入发酵体系，从而改善整个发酵体系菌群的结构。值得注意的是，添加小米椒制作的鲊广椒以假单胞菌（）为主，其平均相对含量为67.35%。由此可见，蔬菜表面的菌群和小米椒自身含有的辣椒素等抑菌物质的含量直接影响着鲊广椒中的菌群结构。隶属于变形菌门（Proteobacteria），而Claesson 等发现Proteobacteria 中包含很多致病菌或条件致病菌，若消费者食用了含有这些微生物类群的发酵食品可能会导致机体产生轻微的炎症。综上所述，小米椒不适于鲊广椒的加工。

图1 不同样本中优势菌属的比较分析Fig.1 Comparative analysis of dominant bacterial genera in different samples

2.2 基于仿生设备对鲊广椒品质的解析

本研究进一步使用电子舌和电子鼻技术对鲊广椒的品质进行了数字化评价，并对鲊广椒的数据矩阵进行整理和统计分析。鲊广椒滋味指标相对强度的点图如图2 所示。

图2 不同样本各滋味指标相对强度的比较的分析Fig.2 Comparative analysis of relative intensity of taste indexes in different samples

由图2 可知，3 类辣椒制作的鲊广椒在后味A（涩味的回味）、后味B（苦味的回味）和丰度（鲜味的回味）上差异不明显，其差异主要体现在酸味、苦味、涩味、咸味和鲜味上，尤其是在酸味上的差异最大。较之小米椒制作的鲊广椒，二荆条和菜椒制作的鲊广椒酸味明显偏高，结合图1 分析可知，这可能与小米椒抑制了乳酸菌的生长繁殖有关。由图2 亦可知，较之小米椒制作的鲊广椒，二荆条和菜椒制作的鲊广椒苦味、咸味和鲜味则明显下降。

本研究进一步对鲊广椒的风味指标进行了比较分析，鲊广椒风味指标相对强度的雷达图如图3所示。

图3 不同样本各风味指标相对强度的雷达图Fig.3 Radar plot of relative intensity of aroma index in different samples

由图3 可知，传感器W1S（对甲烷灵敏）、W1W（对有机硫化物、萜类物质灵敏）和W5S（对氮氧化物灵敏）对3 类辣椒制作鲊广椒的响应差异较大，传感器W2S（对乙醇灵敏）、W2W（对有机硫化物灵敏）、W1C（对芳香类物质灵敏）、W3C（对芳香类物质灵敏）和W5C（对烷烃、芳香类物质灵敏）等5 个传感器对不同鲊广椒的响应差异较小，而传感器W3S（对烷烃灵敏）和W6S（对氢气有选择性）2 个传感器的响应无明显差异。较之小米椒制作的鲊广椒，由二荆条和菜椒制作的鲊广椒其芳香类物质的含量明显偏高，而挥发性物质中有机硫化物、萜类物质和氮氧化物等含量明显偏低，究竟原因可能在于小米椒抑制了鲊广椒中的生长，从而导致其产生的芳香类物质种类或含量减少。

2.3 3 类辣椒制作鲊广椒中微生物多样性的解析

越来越多的报道显示，发酵制品的品质与环境微生物有着密切的联系。为了解和验证鲊广椒中菌群和品质之间的联系，本研究采用Procurstes 分析对鲊广椒中菌群和品质之间的共变化趋势进行了分析，结果如图4 所示。

由图4a 和图4b 可知，添加芹菜、菜椒和二荆条制作的鲊广椒细菌类群和品质均较为相似。由图4c 可知，基于菌群和品质数据的同一样本在空间上的排布具有一定的重叠性，且经Mantel 检验发现两者的共变化趋势显著（＜0.05）。由此可见，通过影响鲊广椒中细菌类群的结构，不同种类的辣椒可对鲊广椒的风味和滋味品质产生影响。本研究进一步对各样本中优势细菌属与品质之间的相关性和显著性进行了计算，结果如图5 所示。

图4 基于OTU 水平的各样本菌群（a）及品质（b）的聚类分析和Procurstes 分析（c）Fig.4 Cluster analysis of the OTU-based flora (a) and quality(b),and Procurstes analysis (c)

图5 优势细菌属和样本品质的相关性分析Fig.5 Correlation analysis of dominant genera and quality of samples

由图5 可知，与传感器W2W 响应强度呈现显著负相关（＜0.05），而和不动杆菌属（）与传感器W2W 响应强度呈现显著正相关（＜0.05），即随着发酵体系中含量的增加或含量的减少，样本挥发性物质中有机硫化物的含量会显著降低（＜0.05）。由图5 亦可知，梭菌属（）与传感器W1S、W5S、W1W 和W2S 响应强度及后味A 和咸味呈显著正相关（＜0.05），而与传感器W1C、W3C 和W5C 响应强度呈显著负相关（＜0.05），这说明鲊广椒中含量过高会降低鲊广椒的风味品质。由此可见，提升鲊广椒发酵体系中的含量能明显抑制鲊广椒中的不良风味，提升芳香类物质的含量，而其他优势菌属均与有机硫化物等不良风味物质呈现显著正相关（＜0.05）。Dan等的研究结果与本研究相似，其发现能利用发酵基质中的碳水化合物产生各种挥发性风味物质，改善产品的风味品质。

结合图1 分析可知，添加二荆条辣椒和菜椒制作的鲊广椒均以为主，因而通过提高鲊广椒发酵体系中的含量，添加两类辣椒可显著提升鲊广椒的品质。鲊广椒因其酸辣的口感而广受欢迎，适宜的酸度和辣度对于鲊广椒的整体品质至关重要，二荆条辣度在5000～15000 SHU，菜椒的辣度低于500～1000 SHU，而芹菜的辣度几乎为0 SHU，因而在鲊广椒制作过程中添加二荆条会使产品品质更被消费者接受，此结果也与农户制作鲊广椒的经验相一致。

3 结论

本研究对小米椒、二荆条辣椒和菜椒制作鲊广椒的细菌群落结构和风味品质进行了比较分析。结果发现，小米椒制作的鲊广椒以为主，挥发性物质中有机硫化物、萜类物质和氮氧化物等含量明显偏高。二荆条和菜椒制作的鲊广椒以为主，细菌群系的多样性和丰度均较小米椒制作的鲊广椒高，且鲊广椒的酸味和芳香类物质的含量明显偏高。进一步分析发现，提升鲊广椒发酵体系中的含量能明显抑制鲊广椒中的不良风味，提升芳香类物质的含量。鲊广椒因口味“酸辣”而深受消费者喜爱，然而菜椒辣度较低，所以二荆条辣椒更适合于鲊广椒的制作。