海南岛橡胶林土壤细菌群落多样性的季节变化及其影响因子

魏亚情，吴志祥，杨 川，兰国玉

（1.中国热带农业科学院 橡胶研究所，海南 海口 570216；2.海南儋州热带农业生态系统国家野外科学观测研究站，海南 儋州 571737；3.海南大学 生态与环境学院，海南 海口 570228）

海南岛是中国纬度最低、面积最大的热带地区[1]。海南橡胶林的分布几乎占到海南岛植被总面积的四分之一[2]。由此可见，热带橡胶林也已成为中国热带地区，特别是海南地区最重要的生态系统[3]，微生物是地球上数量最多、物种极为丰富的生物类群，是生物区系的重要组成部分，参与碳、氮、磷等重要元素的生物地球化学循环，并在促进营养的循环、降解各种污染中发挥着无可替代的作用[4]。与地上植物相比，土壤微生物空间格局与过程，人们了解较少[5]，因此土壤微生物群落构建与多样性格局是生态学中面临的巨大挑战。关于海南热带森林土壤微生物群落分布格局方面的研究较少[6-10]。

微生物的地理分布格局和生态驱动因素已有较多的研究[8,11-17]，土壤理化性质在空间尺度上的异质性，是土壤微生物群落组装和多样性的主要驱动因素[18-20]。然而，对土壤微生物在时间尺度上的变化则研究较少。Chen 等[21]研究表明，汀江微型真核浮游生物群落具有显著的干湿季差异，Zhang 等[22]对华北平原麦田冬季和夏季土壤微生物的研究中，土壤微生物群落表现出显著的季节差异，但空间距离对群落多样性的影响显著大于季节。Voříšková 等[23]研究表明，橡树林土壤真菌随四季的更替，真菌类群的活性、生物量含量、组成和相对丰度都有明显的季节性变化。尽管已有关于土壤微生物时间变化的研究，但大都集中于不同采样月份或年际变化[24-28]。

海南岛具有明显的旱雨季变化，其独特的气候条件对土壤细菌群落的影响如何？目前对此方面的研究还尚有欠缺。因此海南岛橡胶林土壤细菌群落对旱季雨季变化的响应及其驱动因素是本研究重点要解决的科学问题。为探究以上问题，本实验共采集了130 份海南旱季和雨季的橡胶林土壤样本，采用Illumina Miseq 高通量测序技术手段对海南橡胶林旱季和雨季的土壤细菌多样性和群落结构进行了分析，试图阐明海南岛橡胶林土壤细菌群落多样性的季节变化及其影响因子，研究结果为进一步深入分析橡胶林微生物群落、生态功能及天然橡胶产业的可持续发展提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 研究区域与样地

海南岛面积为3.4万km2，属于海洋性热带季风气候，全年温暖湿润，年均温度为22～26℃之间；海南雨量充沛，年降水量在1 000～2 600 mm之间，年平均降水量为1 639 mm，有明显的多雨季和少雨季。每年的5—10月份是多雨季，总降水量达1 500 mm 左右，占全年总降水量的70%～90%；每年11月至翌年4月为少雨季节，仅占全年降水量的10%～30%。橡胶林主要分布在中部山区四周的台地及交通便利，靠近水源地的区域。共选择了5 个样地，分别位于海南儋州、琼中、万宁、乐东和海口。

1.2 样本采集

每个样地中随机设置13 个重复取样点，旱季和雨季各采样一次，每个点采样2 次，分别在2018年1月和7月进行取样，共采集了130 份土壤样本。取样步骤：取样时除去地面植被和枯枝落叶，铲除表面1 cm 左右的表土，以避免地面微生物与土样混杂。用直径为4.5 cm 的取土钻进行采样取土层0～20 cm，混合均匀后过2 mm 筛子后，并按照要求将土样分为3 份，前2 份带回实验室风干处理或鲜样分析，第3份用于高通量分析。用于高通量分析的土样放入液氮罐中，带回实验室放入-80℃的冰箱中保存以待分析。

1.3 DNA 抽提和PCR 扩增

土壤样本由上海美吉生物医药科技有限公司进行高通量测序。细菌采用515FmodF 引物进行PCR 扩增，引物序列为：5′-GTGYCAGCMG CCGCGGTAA-3′[29-30]，扩增程序为：95 ℃预变性3 min，27 个循环（95℃变性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s），最后72℃延伸10 min，扩增体系为20 μL，4 μL5×FastPfu 缓冲液，2 μL 2.5 mmoldNTPs，0.8 μL 引物(5 μmol)，0.4 μLFastPfu聚合酶，10 ngDNA 模板使用2%琼脂糖凝胶回收PCR 产物。

1.4 Illumina Miseq 测序

利用AxyPrep DNA Gel Extraction Kit(AxygenBiosciences，Union City，CA，USA) 进行纯化，Tris-HCl 洗脱，2%琼脂糖电泳检测。利用QuantiFluor ™-ST(Promega，USA)进行定量。根 据Illumina MiSeq 平 台(Illumina，SanDiego，USA)标准操作规程将纯化后的扩增片段构建PE(2×250)的文库。

1.5 数据分析

使用FLASH 软件对原始数据序列进行筛选优化，对优化序列提取非重复序列，按照97%相似性对非重复序列(不含单序列）进行OTU 聚类，得到相似性在97%以上的有效序列[31]。利用RDP classifier(http://rdp.cme.msu.edu/)对每条序列进行物种分类注释，比对Silva 数据库(SSU128)，设置比对阈值为70%[32]，利用mothur 计算不同随机抽样下的α 多样性指数[32]。基于Bray-Curtis 距离，进行主坐标分析（PCoA），揭示了两个季节细菌群落结构相似性，用相似性分析（ANOSIM）分析季节对橡胶林土壤细菌群落结构的季节差异，通过置换多因素方差分析（PERMANOVA）分析不同分组对样品差异的解释度，线性回归分析细菌多样性和环境因子的相关关系，采用RDA 分析来揭示细菌群落与环境因子之间的相关性，计算在R 的‘Vegan’包中进行。

2 结果与分析

2.1 土壤细菌群落组成

通过对海南岛橡胶林不同季节的样本进行高通量测序，共检测到细菌41 门、108 纲、247 目、465 科、876 属。细菌群落中，优势菌门依次为变形菌门(Proteobacteria)(33.28%)、酸杆菌门(Acidobacteria)(19.27%)、绿弯菌门(Chloroflexi)(13.63%)、放线菌门(Actinobacteria)(12.41%)（图1a）。优势纲依次为α- 变形杆菌纲(Alphaproteobacteria)(21.20%)、酸杆菌纲(Acidobacteria)(19.27%)、放线菌纲(Actinobacteria)(12.41%)、浮霉菌纲(Planctomycetacia)(7.70%)、纤线杆菌纲(Ktedonobacteria)(5.78%)、δ 变形菌变形菌纲(Deltaproteobacteria)(4.96%)(图1b)。

旱季和雨季的优势类群相同，但相对丰度比例有差异，在菌门水平上，旱季优势菌门相对丰度依次是变形菌门(31.87%)、酸杆菌门(20.71%)、绿弯菌门(14.05%)、放线菌门(11.53%)，雨季优势菌门相对丰度依次是变形菌门(34.50%)、酸杆菌门(18.03%)、绿弯菌门(13.26%)、放线菌门(13.17%)（图1c）。在纲水平上，旱季优势菌纲相对丰度依次是α-变形杆菌纲(Alphaproteobacteria)(20.85%)、酸杆菌纲(Acidobacteria)(20.71%)、放线菌纲(Actinobacteria)(11.53%)、浮霉菌纲(Planctomycetacia)(8.34%)、纤线杆菌纲(Ktedonobacteria)(6.53%)、δ 变形菌变形菌纲(Deltaproteobacteria)(4.44%)，雨季优势菌纲相对丰度依次是α-变形杆菌纲(Alphaproteobacteria)(21.37%)、酸杆菌纲(Acidobacteria)(18.03%)、放线菌纲(Actinobacteria)(13.17%)、浮霉菌纲(Planctomycetacia)(7.15%)、δ 变形菌变形菌纲(Deltaproteobacteria)(5.42%)、纤线杆菌纲(Ktedonobacteria)(5.12%)(图1d)。

图1 橡胶林土壤细菌不同分类水平中的群落组成Fig.1 Composition of soil bacteria in rubber plantations at different classification levels

用PCoA(主坐标分析、基于Bray-Curtis 距离)排序分析方法对群落组成进行可视化（图2），相似性分析(ANOSIM)结果表明，旱季和雨季土壤样本间群落组成差异显著(R=0.054，P=0.001)。通过置换多因素方差分析(PERMANOVA)分析不同分组对样品差异的解释度，结果表明，季节变化仅能解释细菌群落组成差异的2.48%(R2=0.024 8，P=0.001)。

图2 基于Bray-Curtis 距离的不同季节橡胶林土壤细菌主坐标分析Fig.2 PcoA analysis of bacterial communities of rubber plantations in different seasons,based on Bray-Curtis distance

2.2 土壤细菌群落多样性

α 多样性分析反映微生物群落的丰富度和多样性，从Sobs、ACE 指数、Chao 1 指数和Shannon指数、Simpson 指数分析来看，雨季橡胶林土壤细菌Sobs、ACE 指数和Chao 1 指数显著高于旱季(P＜0.05)，而Shannon 指数高于旱季，Simpson指数低于旱季，但差异都不显著(表1)。

表1 不同季节橡胶林土壤细菌多样性指数†Table 1 Diversity index of soil fungi in rubber plantations in different seasons

2.3 土壤群落多样性与生态因子的相关性

通过线性回归分析可知(图3)，细菌α 多样性与pH 值、全钾(TK)、有效钾(AK)、温度(Tem)、有效磷(AP)显著正相关(pH：R2=0.43，P＜0.001；TK：R2=0.27，P＜0.001；AK：R2=0.26，P＜0.001；Tem：R2=0.26，P＜0.001；AP：R2=0.05，P=0.01)，与土壤含水量(WC)、有机质(SOM)、硝态氮(NN)、全磷(TP)、降雨(Pre)显著负相关(WC：R2=0.16，P＜0.001；SOM：R2=0.03，P=0.04；NN：R2=0.05，P=0.009；TP：R2=0.06，P=0.003；Pre：R2=0.20，P＜0.001)。在所有的环境因子中，pH 值是影响土壤细菌多样性的最重要环境因子。

图3 细菌多样性与环境因子线性相关分析Fig.3 Analysis of linear correlation between bacterial diversity and environmental factors

RDA 分析发现，环境因子中土壤含水量(WC)、有机质(SOM)、pH 值、有效钾(AK)、全氮(TN)、全磷(TP)、全钾(TK)是细菌群落β 多样性的主要影响因子（图4），分别解释了细菌群落组成的7.94%、8.79%、6.13%、6.52%、5.42%、7.79%(表2)。其中，有机质(SOM)对群落组成的解释度最大。

表2 环境因子对微生物群落的解释度Table 2 Percentage of variation in bacterial communities explained by environmental factors,based on RDA results

图4 橡胶林土壤细菌RDA 分析Fig.4 Redundancy analysis of the soil bacterial communities in rubber plantations

3 结论与讨论

本研究采用高通量测序方法对橡胶林土壤细菌群落组成和多样性进行了研究，结果表明，本研究中的细菌优势类群与全球采样尺度上细菌群落的优势菌门一致[33]。此外，我们还发现几种优势菌门在旱雨季的分布情况不同，例如，酸杆菌们和绿弯菌门的相对丰度表现出旱季高于雨季，而变形菌门和放线菌们的相对丰度表现出雨季高于旱季。

本研究还发现，环境因子中pH 值和SOM 分别是α 多样性和β 多样性最主要的影响因子。前人研究报道，pH 值是解释细菌群落多样性和组成的主要环境变量[34-36]，本研究中细菌群落多样性与土壤环境因素有显著的相关性，研究结果证实了在人工林生态系统中pH 值也是细菌多样性最主要的驱动因子[20,37]。土壤理化性质是土壤微生物群落的多样性重要驱动因子[11,18]，RDA 分析结果表明，环境因子中SOM 也是影响细菌群落结构的最主要因素，解释了细菌群落结构总方差的8.79%。

橡胶林土壤细菌群落多样性存在显著的旱雨季差异。有研究表明采样时间对微生物的群落组成影响较小[14,20,26]，而Habekost、Lan 和Voříšková等的结果表明，土壤微生物的群落组成存在明显的季节变化[23-24,38]。本研究结果与后者研究一致，橡胶林土壤细菌群落呈现出显著的季节差异，值得注意的是，季节变化只能解释其总方差的2.48%，可能是因为本研究中存在其他尚未测量的环境因素的影响[39-40]，如微生物间互作（竞争，捕食）[41-42]和生态进程等（休眠，持久性特征等）[43]。