基于UCP2-SIRT3通路探讨瑞舒伐他汀联合丹参川芎嗪注射液对脑缺血/再灌注的影响

田洪涛 姚永新 隋媛 王其亮

(青岛市中医医院(青岛市海慈医院) 1神经外科，山东 青岛 266033； 2健康管理科；3药剂科)

脑缺血/再灌注是长时间大脑严重缺血或缺氧引起的脑梗死，出现脑水肿和脑细胞坏死，损伤器官。在临床上具有较高的发病率和死亡率，严重危害中老年患者健康，需要及时采取措施进行治疗〔1，2〕。瑞舒伐他汀(RS)属于选择性还原酶抑制剂，临床上具有降血脂、抗动脉粥样硬化，治疗脑梗死的作用〔3〕。丹参川芎嗪注射液(DS)为复方制剂，其组分为盐酸川芎嗪，对脑阻塞、脑血栓等脑血管疾病具有较好的效果〔4〕。研究表明，RS类药物联合丹参川芎嗪可以治疗脑缺血、心血管疾病，还可以降低血压等。UCP2-SIRT3信号通路是调控机体氧化应激和线粒体动力的一种途径，已经脑缺血/再灌注疾病中发挥功能〔5〕。本实验基于UCP2-SIRT3通路探讨RS联合DS对脑缺血/再灌注损伤的影响。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1药物 RS购自美国Sigma公司，批号：Y0001719。DS购自贵州拜特制药有限公司，批号：20210209，规格：每支5 ml。将DS稀释成原浓度的15%，配制成100 μmol/L〔1〕。

1.1.2细胞和试剂 人神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y系(中国科学院上海细胞库)；改良培养基(DMEM)培养基、磷酸盐缓冲液(FBS，美国Gibco公司)；噻唑蓝(MTT)试剂盒(上海碧云天生物科技有限公司)；酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒(上海酶联免疫生物科技有限公司)；JC-1染色液(七海复泰生物科技公司)；放射免疫沉淀测定(RIPA)缓冲液、二喹啉甲酸(BCA)试剂盒(北京索莱宝生物科技有限公司)；UCP2单抗、SIRT3单抗、TOMM20单抗、羊抗兔IgG二抗(武汉博士的生物科技有限公司)；Trizol试剂(日本Takara公司)。

1.2方法

1.2.1构建氧糖剥夺/复氧(OGD/R)模型 SH-SY5Y细胞置于DMEM培养基中(不含FBS和抗生素)，在37℃、5%CO2的细胞培养箱条件下，进行氧糖剥夺8 h，之后更换为含10% FBS和1%青链霉素的DMEM培养基，培养24 h，OGD/R模型建立成功。

1.2.2细胞培养和分组 常规培养的SH-SY5Y细胞作为Control组。构建OGD/R模型的细胞作为OGD/R组。采用低浓度(2.5 μmol/L)、高浓度(40 μmol/L)的RS处理OGD/R细胞，再分别添加DS，作为OGD/R+RS-L+DS、OGD/R+RS-H+DS组。将si-NC、si-UCP2转染至OGD/R细胞中，再用高浓度的RS和DS处理，作为OGD/R+si-NC组、OGD/R+si-NC+RS-L+DS组、OGD/R+si-NC+RS-H+DS组，OGD/R+si-UCP2组、OGD/R+si-UCP2+RS-L+DS组、OGD/R+si-UCP2+RS-H+DS组。

1.2.3MTT检测细胞增殖 将细胞接种于96孔板，每孔添加10 μl MTT溶液，37℃条件下培养4 h，离心后去除上清液，向每孔中添加100 μl二甲基亚砜(DMSO)溶液。分光光度计检测各孔450 nm的吸光度。将吸光度换算成细胞存活率。

1.2.4ELISA检测细胞中IL-6、IL-8、IL-10水平

根据ELISA试剂盒的说明书检测细胞中IL-6、IL-8、IL-10水平，实验步骤严格按照操作流程进行。

1.2.5共聚焦法观察UCP2、SIRT3和TOMM20分子表达和定位 用预冷的4%多聚甲醛固定各组细胞15 min，观察细胞形态。在细胞中滴加正常山羊血清，室温封闭1 h。吸弃血清，加入稀释的一抗(1：1 000)，4℃孵育过夜；加入稀释的二抗(1∶2 000)，室温避光孵育2 h。用4，6-二氨基-2-苯基吲哚(DAPI)染色8 min，滴加50%甘油，共聚焦荧光拍照。

1.2.6建立UCP2沉默细胞系 SH-SY5Y细胞在含10% FBS和1%青链霉素的DMEM培养基中培养。将si-UCP2-673、si-UCP2-853、si-UCP2-1235和阴性对照si-NC分别转染至SH-SY5Y细胞中，检测基因和蛋白表达水平，筛选沉默效果最好的UCP2用于后续研究。

1.2.7Western印迹检测细胞中UCP2蛋白表达 收集各组细胞，加入RIPA裂解液提取细胞总蛋白，采用BCA法测定蛋白浓度，应用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离蛋白，将分离的蛋白凝胶转移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，封闭2 h，室温孵育一抗稀释液(UCP2稀释比1∶1 000)，4℃孵育过夜，TBST洗涤，孵育二抗稀释液(稀释比1∶2 000)，室温孵育1 h，TBST洗涤，滴加ECL显影，应用ImageJ软件分析各条带灰度值。

1.2.8qRT-PCR检测细胞中UCP2 mRNA和PGC1、Drp1、Opa1 mRNA表达 采用Trizol法提各组细胞中总RNA，应用Nanodrop2000c超微量分光光度计检测RNA浓度。反转录将总RNA反转录为cDNA。反应条件：25℃ 10 min，37℃ 60 min，95℃ 5 min，4℃保存。反转录体系：RNA 2 μl，10×RT缓冲液2 μl，dNTP 0.4 μl，Multiscripe RT 1 μl，10×Random Primer 2 μl，RNase-Free ddH2O补足体系至20 μl。以cDNA为模板进行qRT-PCR扩增，反应体系：SYBR Green Master Mix 10 μl，正反向引物0.8 μl，cDNA 1 μl，RNase-Free ddH2O补足体系至20 μl；反应条件：95℃ 2 min，95℃ 15 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s，共循环40次。UCP2：上游引物5′-TAGACGTGGTCAAGACGAGATA-3′，下游5′-AGGGCATGAA CCCTTTGTAG-3′。PGC1：上游引物5′-CCAAACCAACAACTTTATCTCTTCC-3′，下游5′-CACACTTAAGGTGCGTTCAATAGTC-3′；Drp1：上游引物 5′-CACCCGGAGACCTCTCATTC-3′，下游5′-CCCCATTCTTCTGCTTCCAC-3′；Opa1：上游引物5′-GTGCTGCCCGCCTAGAAA-3′，下游5′-TGACAGGCACCCGTACTCAGT-3′； GADPH：上游引物5′-AGGTTGTCTCCTGCGACTTC-3′，下游5′-CTTGCTCAGTGTCCTTGCTG-3′。以GADPH为内参。采用2-ΔΔCt法计算基因相对表达量。

1.3统计学处理 采用SPSS21.0软件进行t检验，方差分析。

2 结 果

2.1RS联合DS对脑OGD/R细胞增殖的影响 与Control组〔(100.00±10.92)%〕相比，OGD/R组细胞存活率显著降低〔(41.40±4.33)%，P<0.05〕；与OGD/R组相比，OGD/R+RS-L+DS组、OGD/R+RS-H+DS组细胞存活率显著升高〔(78.94±9.11)%、(86.49±7.37)%，P<0.05〕。

2.2RS联合DS对脑OGD/R细胞炎性因子水平的影响 与Control组相比，OGD/R组细胞IL-6、IL-8、IL-10水平显著升高(P<0.05)；与OGD/R组相比，OGD/R+RS-L+DS组、OGD/R+RS-H+DS组细胞IL-6、IL-8、IL-10水平显著降低(P<0.05)。见表1。

表1 RS联合DS对脑OGD/R细胞炎性因子水平的影响

2.3建立UCP2沉默细胞系 与NC组相比，si-NC组UCP2 mRNA和蛋白表达水平及浓度无显著变化(P>0.05)，si-UCP2-673组、si-UCP2-1235组UCP2 mRNA和蛋白表达水平及浓度显著降低(P<0.05)；与NC组、si-NC组比较，si-UCP2-853组UCP2 mRNA和蛋白表达水平及浓度极显著降低(P<0.05)。所以，采取UCP2-853进行后续实验。见表2，图1。

表2 建立UCP2 沉默细胞系

1～5：NC组、si-NC组、si-UCP2-673组、si-UCP2-853组、si-UCP2-1235组图1 各组UCP2蛋白表达

2.4RS联合DS对脑OGD/R细胞UCP2、SIRT3和TOMM20分子表达和定位的影响 与Control组相比，OGD/R组细胞UCP2、SIRT3免疫荧光明显减弱(P<0.05)；与OGD/R组相比，RS联合DS显著增强细胞UCP2、SIRT3免疫荧光(P<0.05)。见表3。抑制UCP2表达前后，各组SIRT3表达水平无显著差异(P>0.05)。抑制UCP2表达前，与OGD/R-si-NC组比较，RS联合DS显著升高TOMM20表达水平(P<0.05)；抑制UCP2后，各组TOMM20表达水平均显著降低(P<0.05)。见表3。

2.5RS联合DS对脑OGD/R细胞PGC1、Drp1、Opa1 mRNA表达的影响 与Control组相比，OGD/R组PGC1 mRNA表达水平显著升高，Drp1、Opa1 mRNA表达水平显著降低(P<0.05)。与OGD/R组相比，OGD/R+RS-L+DS组、OGD/R+RS-H+DS组PGC1 mRNA表达水平显著降低，Drp1、Opa1 mRNA表达水平显著升高(P<0.05)。与OGD/R组或OGD/R+si-NC组相比，OGD/R+si-UCP2组PGC1 mRNA表达水平显著升高，Drp1、Opa1 mRNA表达水平显著降低(P<0.05)。与OGD/R+RS-L+DS组或OGD/R+si-NC+RS-L+DS组相比，OGD/R+si-UCP2+RS-L+DS组PGC1 mRNA表达水平显著升高，Drp1、Opa1 mRNA表达水平显著降低(P<0.05)；与OGD/R+RS-H+DS组或OGD/R+si-NC+RS-H+DS组相比，OGD/R+si-UCP2+RS-H+DS组PGC1 mRNA表达水平显著升高，Drp1、Opa1 mRNA表达水平显著降低(P<0.05)。见表3。

表3 RS联合DS对脑OGD/R细胞UCP2、SIRT3和TOMM20分子表达荧光强度、PGC1、Drp1、Opa1 mRNA表达的影响

3 讨 论

脑缺血/再灌注是大脑在长时间缺血缺氧情况下造成的组织不可逆损伤，减弱了增强线粒体功能，降低线粒体跨膜转运和能量代谢，抑制脑细胞存活〔7，8〕。RS治疗动脉粥样硬化性脑血管病的临床效果较好，安全性较高〔9〕。RS可以降低脑梗死患者血脂、炎症因子水平，临床价值显著，没有不良反应〔10〕。DS是由丹参提取液和盐酸川芎嗪组成的，DS下调了急性脑梗死患者血清hs-CRP、TNF-α、IL-6水平，改善了脑环境〔11〕。DS能有效减轻脑神经功能损伤，改善血液流变，治疗脑血栓〔12〕。有类似的研究报道，丹红注射液联合RS治疗不稳定型心绞痛〔13〕。复方丹参滴丸联合瑞舒伐他汀治疗冠心病合并的高脂血症〔14〕。已经有文献结果，RS通过UCP2-SIRT3信号调控降低脑脑缺血/再灌注对神经元的损伤，减低OGD/R细胞凋亡，提高细胞存活率，阻止OGD/R细胞膜电位下降〔15〕。RS通过调控UCP2-SIRT3通路减轻脑缺血/再灌注对神经元线粒体的损伤，增加OGD/R细胞中UCP2、SIRT3分子表达〔16〕。综上，RS联合DS通过调控UCP2-SIRT3通路减轻脑缺血/再灌注造成的损伤，为治疗该疾病提供理论基础。