盐度对笼目海带配子体生长发育的影响

陈书秀 孙娟 李霞 赵楠 史良 李晓捷

(山东东方海洋科技股份有限公司，国家海藻与海参工程技术研究中心，山东省海藻与海参技术创新中心，山东省海藻遗传育种与栽培技术重点实验室，山东烟台 264003)

笼目海带(Saccharinasculpera)又称厚叶切氏海带、厚叶解曼藻，隶属于褐藻门、褐藻纲、海带目、海带科，其营养丰富，是海带中的优势品种。该藻体内含有优质岩藻聚糖硫酸酯、褐藻胶等各种活性成分，其酶解产物或水提物又含有各种次级代谢产物和挥发性风味物质[1]。根据这些活性成分，可以研发各类保健类食品、医药产品等[2-3]。因此，笼目海带的市场需求日益增大。近年来，有关笼目海带的报道主要针对其黏性多糖的性质、褐藻胶的提取方法以及多糖的生物活性的研究等方面[4-12]，对于笼目海带养殖育苗方面的研究较少[13-14]。利用配子体进行育苗是推进笼目海带大规模育苗及海上养殖的新技术工艺，其中配子体的快速同步促熟是该工艺的关键技术。陈书秀等[13-14]研究发现，笼目海带配子体发育的最适温度为8～12 ℃，在光照强度20 μmol·m-2s-1下，20L(光照)∶4D(黑暗)的光照周期对配子体发育最有利。

除了温度、光照、营养盐等环境因子以外，盐度也对海藻生长、发育及繁殖起着重要作用。当海藻处于盐分逆境时，海藻的生长受阻，其光合生理作用也会受到影响。如在低盐度条件下，坛紫菜(Porphyrahaitanensis)和裂片石莼(Ulvafasciata)的有效光化学速率和光合放氧速率均受到显著影响[15-16]。刘萌萌等[17]研究表明，盐度达到15后穗花狐尾藻(Myriophyllumspicatum)生长停滞，藻体逐渐死亡。宋新丹等[18]研究发现，盐胁迫逆境会显著影响羊栖菜(Sargassumfusiforme)幼体的光合放氧能力。另外，盐度对海藻的游孢子附着或配子体萌发等有显著影响，萱藻(Scytosiphonlomentaria)孢子附着的最适盐度为30，盐度过低(≤24)或过高(≥40)都会造成孢子死亡[19]。孔石莼(UlvapertusaKjellm)在盐度20和25的条件下最有利于其体细胞转化成繁殖细胞，而在盐度5的条件下体细胞仅有少数继续发育[20]。

本研究以笼目海带雌、雄配子体为试验材料，通过显微观察配子体的生长发育状态，计算配子体发育率等，探究不同盐度对笼目海带配子体生长发育的影响，旨在探索有利于笼目海带配子体发育的最适盐度条件，为笼目海带配子体规模化扩增培养及育苗提供数据参考。

1 材料和方法

1.1 试验材料及培养条件

试验用海带配子体为笼目海带。取适量的雌、雄配子体分别用孔径50 μm(300目)筛绢过滤，获得2～5个细胞的细胞段悬浊液。然后按照雌、雄质量比2∶1混合均匀，取10 mL悬浊液加入直径12 cm的培养皿中，在不同的温度下进行培养，光周期为10L∶14D，光照强度为20 μmol·m-2s-1。在不同盐度的海水中添加NaNO3、KH2PO4、柠檬酸铁作为培养液，培养液中总有效氮为10 mg/L，有效磷为1 mg/L，有效铁为0.05 mg/L。采用海水素配制盐度分别为15、20、25、30、35、40、45的海水，每个处理组设3个重复，每3 d镜检观察并更换培养液，培养周期为30 d。

1.2 配子体生长、发育指标的测定

在显微镜下观察配子体的生长发育状态，每3 d拍照1次，试验周期为30 d。

配子体发育率的计算：每个培养皿随机观察10个100×视野，分别统计卵囊形成、排卵、幼孢子体和总细胞数，发育率(%)=100×(卵囊形成数+排卵数+孢子体数)/总细胞数。

1.3 数据处理

用SPSS 19.0软件对发育率数据进行单因子方差分析和多重比较分析，设P<0.05为差异显著，P<0.01为差异极显著。采用EXCEL软件作图。

2 结果

2.1 不同盐度对笼目海带配子体细胞形态的影响

当盐度为45时，笼目海带配子体克隆系仅进行营养生长而不进行发育，整个试验观察期内均无卵囊形成，其外观形态变化见图1-a～c。在盐度20～35的条件下，15 d后，约有3%的雌配子体发育为成熟的卵囊(见图1-d)；15～28 d，大部分配子体萌发成为成熟卵囊、排卵并形成幼苗(见图1-e～f)。

a.打碎后的雌配子体；b.雌配子体营养生长初期；c.雌配子体营养生长后期；d.雌配子体卵囊形成；e.雌配子体排卵；f.幼孢子早期形态。图1 笼目海带雌配子体生长发育过程

第28天时，不同盐度下笼目海带配子体生长发育状态见图2。当盐度为45时，随着培养时间的延长，笼目海带配子体细胞段分支颜色加深，细胞质分布均匀，细胞段数目增多，配子体的细胞数量显著高于其他各组(见图2-g)；盐度40处理组与盐度45处理组没有显著差异，仅在第28天时观察发现有极少量的孢子体(见图2-f)；在盐度为20、25和30的条件下，配子体发育率在60%～80%，其中50%左右为多细胞孢子体(见图2-b～d)；盐度35处理组最终的卵囊形成率、排卵率及小苗率显著低于盐度20～30处理组(见图2-e)；而盐度15处理组的配子体细胞膨大呈球形，后期大量死亡，极少数的存活细胞生长极度缓慢且不进行发育(见图2-a)。

a.盐度15；b.盐度20；c.盐度25；d.盐度30；e.盐度35；f.盐度40；g.盐度45。图2 不同盐度下笼目海带配子体生长发育状态(第28天)

2.2 不同盐度对笼目海带配子体由营养生长转向发育生殖的影响

在海带配子体发育成幼苗的过程中，雌配子体卵囊形成、排卵和幼苗出现时的形态变化明显，易于观察和统计，因此选择发育率，即卵囊形成数、排卵数和幼孢子体数之和占总细胞数的百分比作为衡量海带配子体发育的指标[21]。

不同盐度、培养天数对笼目海带配子体发育的方差分析结果见表1。由表1可以看出，盐度(P<0.001)、培养天数(P<0.001)及二者交互作用(P<0.001)对笼目海带配子体的发育均有极显著的影响。第1行校正模型中的F=88.479，P<0.001，表明所用模型有统计学意义。盐度的偏Eta2(0.952)>(培养天数×盐度)的偏Eta2(0.933)>培养天数的偏Eta2(0.906)，表明这3个因素对笼目海带发育的影响效应为：盐度>培养天数×盐度>培养天数。

表1 不同盐度、培养天数对笼目海带配子体发育的方差分析结果

不同盐度条件下笼目海带的发育情况见表2。配子体发育培养第15天，在盐度20～35处理组发现有卵囊形成并排卵，其他盐度处理组的配子体均处于营养生长。盐度15、45处理组在整个培养周期中均未见配子体发育，盐度40处理组仅在第28天观察到少量的孢子体。多重比较结果表明，在整个培养周期中，盐度对笼目海带配子体发育率有显著的影响(P<0.05)(见表3)。从第19天开始，盐度20～30处理组的发育率显著高于其他各组(P<0.05)。第28天，盐度25、30处理组的最终发育率为79.26%、71.36%，盐度20处理组的最终发育率为58.87%(见表3)。

表2 不同盐度条件下笼目海带的发育情况 单位：%

表3 盐度对笼目海带配子体发育率的影响 单位：%

综上所述，在盐度20～35条件下，笼目海带配子体均可正常发育。从最终发育率及幼孢子体存活率情况可见，最适于笼目海带配子体发育的盐度为25～30，适当降低海水盐度有利于促进配子体由营养生长转向发育生殖。高盐度(35～45)更有利于配子体的营养生长，但对笼目海带配子体的发育会产生抑制作用。

3 讨论

盐度作为海水介质的重要参数，对海藻生长、发育及繁殖起到重要作用。近几年，有关盐度变化对大型海藻生长影响的研究主要集中在成熟藻体，在海藻早期发育阶段如游孢子或配子萌发等的研究较少。本试验以笼目海带配子体为材料，研究了不同盐度对其配子体发育的影响，结果表明，在盐度20～30条件下，笼目海带配子体大部分(60%～80%)进入了生殖生长状态，且其中50%以上为多细胞孢子体。在盐度35的条件下，大部分笼目海带配子体(80%～90%)维持在营养生长状态，虽然小部分配子体(7.30%)进入了生殖生长状态，但生殖生长明显滞后于盐度20～30处理组。在盐度40和45条件下，所有海带配子体维持在营养生长状态。此结果与孔石莼[20]、宽礁膜[22]等海藻的早期发育条件相似。王帅[20]研究表明，孔石莼在低盐度(盐度5)条件下，其体细胞仅有少数继续发育成繁殖细胞；盐度在10～25的条件下对孔石莼体细胞成熟有一定的促进作用，其中盐度为20和25时最有利于孔石莼体细胞转化成繁殖细胞。王惠[22]研究表明，在低盐度(盐度10)条件下，宽礁膜游孢子不能正常萌发，在高盐度(盐度40)条件下，游孢子大部分处于休眠状态，只完成细胞增大，不分裂。

本研究中，不同盐度下笼目海带最终发育率及幼孢子体存活率的结果表明，最适合于笼目海带配子体发育的盐度为25～30，适当降低盐度有利于促进配子体由营养生长转向发育生殖。高盐度(35～45)更有利于配子体的营养生长，但会对笼目海带配子体发育产生抑制作用。因此，在笼目海带配子体培养过程中，可以通过盐度的变化来调控配子体的生长发育。