小型综合科研实验培养医学生科研能力的探索

胡 俊， 赵 熠， 杨国华， 赵 旻， 武军驻

（武汉大学基础医学院，武汉 430072）

0 引 言

基础医学是医学教育的理论基础，基础医学实验教学是理论知识和实践操作的连接，是培养学生科研能力的重要途径。《国家中长期教育改革和发展规划纲要（2010-2020年）》要求高等院校“针对不同层次、不同类型人才培养的特点，改进专业培养方案，构建科学的课程体系和学习支持体系”。传统的基础医学实验教学体系通常以形态学、机能学、病原生物学、解剖学、分子生物学等专业进行划分，教学过程中强调本学科实验知识技术的应用性和独立性，使知识体系有所割裂。近些年来，国内一些医学院校在尝试进行基础医学实验教学改革，通过课程整合使之成为结构性好、整体协调的新型课程［1-5］，使学生能在短时间内系统掌握各基础医学实验的原理和操作。实验教学改革更重要的目的是培养学生的科研意识、科研思维和科研能力，激发学生的科研热情和科研兴趣，提高学生的综合科研素质［6-9］。

本研究以目前在生物医学科研领域应用广泛的荧光蛋白报告系统和慢病毒表达系统为切入点，一方面将两项重要实验技术融合为一个小型综合实验，培养本科生开展系统科研的能力，另一方面更着重于引导本科生了解生物医学科研前沿，培养他们对科研的兴趣和热爱，为推进学生自主开展大学生创新训练科研项目、提前进入PI（principle investigator）学术带头人实验室从事科学研究等提供扎实的实验基础。

1 实验设计

绿色荧光蛋白（Green fluorescent protein，GFP）及其演变来的突变体（红色荧光蛋白RFP、黄色荧光蛋白YFP等）因具有良好的荧光激发特性、稳定的真原核细胞表达、分子量较小易于进行基因融合表达等特性，被广泛应用为蛋白质定位的分子标记和报告基因，是当前生物及生物医学研究中应用最为广泛的一类荧光标记。

在生物医学研究中，GFP作为荧光标记被广泛应用于细胞和动物水平的研究［10-11］。在细胞水平上，利用基因融合技术，将目的基因与荧光蛋白序列融合表达，从而开展目标基因时空表达、细胞器及功能位点活细胞定位、亚细胞水平细胞器动态变化等研究。在动物水平上，荧光蛋白主要作为荧光标记用于小动物活体荧光成像。小动物活体成像技术采用高灵敏度制冷CCD相机配合特制的成像暗箱和图像处理软件，可以直接监控活体动物体内的细胞活动和基因行为。利用小动物活体成像技术，可以观测活体动物体内肿瘤的生长及转移、感染性疾病发展过程、特定基因的表达等生物学过程［12-15］。

GFP在细胞水平的应用可通过瞬时转染细胞或是构建稳定转化细胞系实现，使用稳定转化的荧光标记细胞株开展细胞水平研究比瞬时转染更为方便，且实验结果也更为稳定可靠。在动物水平上使用GFP作为荧光标记进行长期动态观察，则以使用稳定转化的荧光标记细胞系为佳。因此，稳定转化的荧光标记细胞株在生物医学科研中具有广泛的应用，构建稳定转化的荧光标记细胞株对于开展生物医学科研具有非常重要的作用。

目前，构建稳定转化细胞系效率最高的技术途径是慢病毒技术［16-17］。慢病毒载体是基于人类免疫缺陷I型病毒（HIV-1）为基础发展起来的载体系统，由包装载体和表达载体两部分组成。慢病毒载体系统删除了全部HIV-1的编码基因，在介导目标基因表达时不会表达HIV-1蛋白，其安全性已在国内外长期科研实践中得到了充分证实。

小型综合科研实验的内容和技术路线如图1所示。通过构建一个基于慢病毒系统的GFP表达载体，经慢病毒包装和感染后筛选获得稳定表达GFP的A549细胞系，再使用该稳转细胞系进行裸鼠成瘤实验，最后活体观察裸鼠体内肿瘤的绿色荧光。

图1 实验技术路线

这个实验项目融合了基因克隆、载体构建、细胞培养、瞬时转染、病毒收集、病毒感染、裸鼠成瘤等分子生物学实验、细胞学实验、病毒学实验和动物实验，又涉及激光共聚焦显微镜、流式细胞仪、小动物活体成像系统等常用大型实验设备的使用，具有很强的综合性。这个实验项目旨在带领医学本科生从实验目的、实验设计、实验安排、实验实施等多个方面了解生物医学科研如何由浅显到深入的开展，对医学本科生进行系统科研启蒙。

2 实验材料

2.1 质粒和细胞株

真核荧光表达质粒pEGFP-C1、慢病毒表达质粒PLVX-PURO、慢病毒包装质粒psPAX2和pMD2.G、人肾上皮细胞系HEK293T和人非小细胞肺癌细胞系A549均来自武汉大学基础医学院基础医学实验教学中心。

2.2 主要试剂

分子克隆所用超强高保真PCR试剂盒、DNA分子量标准品D2000 DNA marker和1 kb plus ladder、DNA产物纯化试剂盒购自天根生化科技（北京）有限公司；内切酶XmaI、XbalI和T4 DNA连接酶购自NEB。

细胞实验所用的DMEM培养基、MEM培养基、胎牛血清、PBS、胰酶消化液购自Hyclone；脂质体核酸转染试剂购自翌圣生物科技（上海）股份有限公司。

2.3 主要仪器

二氧化碳培养箱（德国宾得）、倒置荧光显微镜（奥林巴斯）、激光共聚焦显微镜（奥林巴斯）、流式细胞仪（贝克曼Cytoflex）、小动物活体成像仪（美国BRUKER）。

3 实验方法和结果

3.1 慢病毒GFP荧光载体构建

慢病毒GFP荧光载体PLVX-Puro-GFP的质粒结构如图2（a）所示。以pEGFP-C1质粒为模板，使用引物GFP-FULL-XmaI-F和GFP-FULL-XbaI-R（见表1）扩增获得GFP片段［见图2（b）］；使用XmaI和XbaI双酶切PCR扩增的GFP片段和PLVX-Puro质粒，回收片段和质粒后进行连接和转化［见图2（c）］。从转化平板上随机挑选3个单菌落小摇培养过夜后，以菌液为模板，使用引物GFP-F和GFP-R（见表1）进行PCR检测，发现3个克隆中有2个能扩增出目标条带，为GFP阳性克隆［见图2（d）］；将2个GFP阳性克隆提取质粒，使用XmaI和XbaI双酶切进行酶切鉴定，电泳检测能观察到载体片段和GFP插入片段［见图2（e）］，进一步确认这2个克隆为阳性克隆。测序显示插入的GFP片段序列完全正确，阳性克隆可用于后续实验。

图2 慢病毒GFP表达载体PLVX-Puro-GFP的构建

表1 载体构建所用引物

3.2 慢病毒稳定转化的A549-GFP荧光细胞系构建

（1）细胞培养。HEK293T细胞培养于含有10%FBS的DMEM完全培养基中；A549培养于含有10%FBS的MEM完全培养基中。细胞培养于37℃、5%CO2的饱和湿度培养箱中，细胞融合度达到90%时使用胰酶消化液常规消化传代。

（2）慢病毒包装。使用慢病毒包装质粒psPAX2、pMD2.G和表达质粒PLVX-Puro-GFP共同转染293T细胞，转染48 h后荧光显微镜下观察GFP绿色荧光，发现大多数293T细胞中都能观察到绿色GFP荧光信号，说明转染效率较好，慢病毒包装成功［见图3（a）］。收集培养基，0.45 μm滤器过滤后即得慢病毒毒液。

图3 稳定转化A549-GFP荧光细胞系的建立

（3）慢病毒感染A549细胞及药物筛选。提前1

天将A549细胞转入6孔板中培养，每孔加入0.5 mL

慢病毒毒液，感染24 h后更换含有嘌呤霉素的完全培养基进行药物筛选和持续培养。传代2次后进行检测，激光共聚焦显微镜拍摄观察发现绝大多数细胞都有GFP荧光［见图3（b）］，流式细胞术检测结果显示97.5%的细胞为GPF阳性细胞［见图3（c）］，说明筛选获得的A549-GFP荧光细胞系纯度很高，可以用于后续成瘤实验。

3.3 A549-GFP细胞成瘤及活体荧光检测

将A549-GFP细胞扩大培养后制成107／0.1 mL细胞悬液（PBS重悬），注射于4周龄裸鼠皮下。注射后7天左右即可观察到皮下有肿瘤形成，培养3周后肿瘤明显增大［见图4（a）］。将麻醉后的成瘤裸鼠放置于小动物活体成像仪中进行检测，在488 nm左右的激发光下，能观察到强烈的荧光信号［见图4（b）］。

图4 活体检测肿瘤荧光

4 结 语

本项目将荧光蛋白报告系统和慢病毒表达系统这两项重要科研技术融合建立了一个小型综合实验，带领医学本科生从实验目的、实验设计、实验安排、实验实施等多个方面，真真切切了解生物医学科研如何由浅显到深入地开展，如何合理地设计和开展科研实验，真切体会一个综合实验的完整实施历程，培养本科生的科研素质。

本综合实验中既有基因克隆、载体构建等分子生物学实验，又有细胞培养、瞬时转染等细胞学实验，还有慢病毒包装、慢病毒收集、慢病毒感染等病毒学实验，同时还设计了裸鼠成瘤及小动物活体观察肿瘤荧光信号等动物学实验，涉及激光共聚焦显微镜、流式细胞仪、小动物活体成像系统等大型仪器的操作使用，是一个融合了多种专业实验技术和检测手段的综合实验项目，既能面向医学本科生作为系统科研的启蒙，也能面向研究生作为科研技术培训项目。