活检取材部位和方法对公民逝世后器官捐献供肾组织病理学评估的影响

陈剑霖，郭晖（华中科技大学同济医学院附属同济医院器官移植研究所，器官移植教育部重点实验室，国家卫生健康委员会器官移植重点实验室，中国医学科学院器官移植重点实验室，湖北 武汉 430030）

随着2015 年我国全面进入公民逝世后器官捐献（donation after citizen's death，DCD）时代以及随后扩大标准供肾（extended criteria donor，ECD）被逐渐接纳使用［1-3］，供器官的病理组织学评估结果对供器官取舍的选择起到至关重要的作用。在病理评估中对供器官进行取材是第一个关键环节，取材的质量决定病理医生是否能对供器官进行精准的评估［4］。但是目前对于取材部位和取材方式对供器官评估影响的研究较少，针对供器官取材操作的指南和规范也尚未出台。虽然各个移植中心的获取团队对于活检标本获取有各自的方式，但是对于很多穿刺操作的细节目前还没有相关文献进行具体探究。因此我们利用本中心经评估后弃用肾脏，针对肾脏不同部位取材并模拟评估，探究不同取材部位对DCD 供肾评估结果的影响。通过与供器官获取时评估结果对比，寻找现有方法获取的穿刺组织可能存在的问题。该项研究可为今后供器官活检取材操作的指南和规范的制定提供一定的理论依据。

1 资料与方法

1.1研究对象：收集华中科技大学同济医学院附属同济医院器官移植研究所在2019 — 2022 年10 例经评估后弃用的肾脏标本。

1.2方法

1.2.1活检取材：将弃用肾脏经充分解剖剥离肾周脂肪及纤维组织后，将弃用肾脏沿中轴剖开并在被膜表面于肾脏上级，中部和下级分别选择2 个活检取材位点，用手术尖刀在皮质部按前述定位点分别切取边长约5 mm，厚度约3 mm 的正方形块状肾活检标本。活检标本及时置于Bouin’s 固定液中。

1.2.2常规石蜡切片：将组织按如下步骤处理。Bouin’s 固定液12 h，75%乙醇2 h，85%乙醇2 h，95%乙醇2 h，无水乙醇3 h，二甲苯Ⅰ 40 min，二甲苯Ⅱ 40 min，浸蜡2 h。浸蜡后将组织包埋，然后进行2 μm 厚度石蜡切片。

1.2.3染色方法：制片完成后执行常规苏木精-伊红（hematoxylin-eosin staining，HE）染色。

1.3制片结果分析

1.3.1解剖标本活检评估：本科室移植病理学医师模拟供器官评估，统计标本中肾小球数量及硬化率、小动脉数量、小动脉内膜增厚数量及其比例和小动脉透明样变数量及其比例，并根据Banff 评分、Remuzzi 评分、Maryland 评分以及Pirani 评分对组织进行模拟评估［5-8］。最后将结果进行统计学分析。

1.3.2解剖标本与穿刺标本评估结果的比较：将上述解剖标本活检评估的结果与供肾获取时穿刺标本评估的结果对比并进行统计学分析。

1.3.3单位面积下解剖标本与穿刺标本的肾小球与小动脉数量的比较：通过统计取材标本及供器官获取评估时穿刺标本的面积，按如下方法计算每平方厘米标本中肾小球和小动脉获得率。

单位面积肾小球获得率＝肾小球数量×（1/标本面积）

单位面积小动脉获得率＝小动脉数量×（1/标本面积）

1.4统计学分析：结果采用Excel 软件对获取的数据进行统计学处理，计量资料采用均数±标准差（±s）表示，组间比较的分析方式采用t 检验，P ＜0.05 表示差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1 供者资料：本研究中，10 例弃用供肾来自6 例不同的供者，具体资料如表1 所示。其中男性供者4 例，女性供者2 例。供者平均年龄为47.2（38 ～63）岁，平均BMI 为24.1（17.6 ～30.9）。供者高血压病史1 例，糖尿病病史1 例。死亡原因脑出血5 例，缺血缺氧性脑病1 例。供者捐献前行心肺复苏术2 例。

表1 供者一般资料

2.2 不同部位取材标本的组织病理学形态比较：不同取材部位标本的HE 染色结果如图1 所示。我们发现从弃肾3 个不同部位取材的切片中均存在一定程度的肾小球硬化、小动脉内膜增厚以及小动脉透明样变的病变，病变范围及表现较为一致。其中小动脉病变程度普遍较重。另外3 个不同部位取材切片的肾组织间质均表现出局灶性纤维组织增生，同时3 个不同部位取材切片中肾小管上皮细胞均存在脱落坏死的情况。

图1 不同取材部位肾脏病理组织形态学比较（HE ×100）

2.3 不同部位取材标本评估结果的比较：为了探究弃用肾脏不同取材部位的具体病变程度的差异，我们对其进行量化比较，结果如图2 所示。从图中我们发现从肾脏不同部位获取的标本中可观察到的肾小球数量、小动脉数量及其相对应的病变组织的数量均没有统计学差异。模拟供肾评估对不同部位标本进行评分发现不同取材部位标本的Banff 评分、Remuzzi 评分、Maryland 评分和Pirani 评分均没有统计学差异。结果表明从不同部位对肾脏进行取材活检对评估结果没有显著影响。

图2 弃用肾脏不同部位取材标本肾小球和小动脉数量以及慢性病变程度及不同评分系统中分数的比较

2.4 解剖标本与穿刺标本评估结果的比较：进一步探究了解剖标本与对应的供肾获取时穿刺标本评估结果的差异，结果如图3 所示。在组织固有结构数量方面，解剖标本中肾小球数量为（42.9±25.4）个，小动脉数量为（21.9±13.8）个，穿刺标本中肾小球数量为（13±3.8）个，小动脉数量为（9.4±3.8）个，结果具有显著统计学差异。两种活检标本中肾小球硬化数量、小动脉内膜增厚数量以及小动脉透明样变数量没有显著差异。在病变范围表现方面，解剖标本中肾小球硬化率为25%±23.2%，小动脉内膜增厚比例为46.5%±22.8%，小动脉透明样变比例为59.3%±16.4%，而穿刺标本中肾小球硬化率为42%±8.8%，小动脉内膜增厚比例为68%±27%，小动脉透明样变比例为86%±17.4%，结果均具有统计学差异。仅Banff 评分中穿刺标本的肾小球硬化评分为（2.2±0.4）分，解剖标本肾小球硬化评分为（1.6±0.9）分，结果具有统计学差异。其他项评分中两者均不存在差异。该结果说明穿刺标本在评估供肾病变范围方面可能高于供肾实际情况，但是在评分方面穿刺标本结果基本可以反映肾脏真实慢性病变情况。

图3 肾脏解剖标本与对应穿刺标本肾小球和小动脉数量以及慢性病变比例及不同评分系统中分数的比较

2.5 解剖标本和穿刺标本在单位面积下肾小球和小动脉数量的比较：由于解剖标本面积大于穿刺标本，所以解剖标本中肾小球和小动脉的数量多于穿刺标本。因此为了消除因面积而产生的差异，我们计算单位面积（1 cm2）下，两种标本的肾小球和小动脉数量，结果如图4 所示。通过计算我们发现每个单位面积中穿刺标本的肾小球数量小于解剖标本，数量分别为（199.3±50.7）个/cm2和（240.6±57.4）个/cm2。但是穿刺标本的小动脉数量大于解剖标本，数量分别为（153.5±76.9）个/cm2和（114.9±43.7）个/cm2。结果具有统计学差异。

图4 肾脏解剖标本与对应穿刺标本在单位面积下肾小球和小动脉数量的比较

3 讨 论

在供器官的选择过程中，组织病理学评估结果具有非常重要的指导意义。目前相关的供器官评估评分系统多达15 种［9-11］。虽然目前还没有最佳的供肾评分系统［12］，但是一致的观点是病理医生需要从活检标本中观察到足够数量的肾脏固有结构才能使用相关评分系统。然而由于目前对于取材方法尚未有明确的操作规范和指南，导致现在供器官的病理组织活检取材量非常有限［13］，并且活检往往存在采样误差［14-16］。Haas 等［17］的研究表明目前在评估动脉纤维内膜增厚及动脉硬化时结果往往不可靠，并且肾小球硬化率和间质纤维化的趋势容易被高估。而目前关于供器官获取时取材部位和方式的研究较少。因此，本研究旨在探究取材部位和方式对供器官病理组织学评估的影响。

首先为了探究不同部位取材对供器官组织病理学评估的影响，我们利用本中心经评估后弃用肾脏，分别针对肾脏不同位置进行活检取材并通过模拟评估的方式统计活检结果。我们发现不同部位取材的标本中可观察到的肾小球和小动脉数量没有差异，对活检标本模拟供肾评估后发现上述标本在Banff 各项评分、Remuzzi 评分、Maryland 评分以及Pirani 评分中均没有显著性差异。我们的研究表明，肾脏不同部位的固有结构数量相对较为平均，并且肾脏慢性改变在肾皮质区域的表现较为均一，较少出现慢性局灶性病变。

因为解剖标本取材范围较大，更能反映供肾真实的病理改变，所以我们比较解剖标本与获取时穿刺标本的差异。结果表明虽然穿刺标本在肾小球和小动脉病变范围上大于解剖标本，但是在供肾评分方面仅在Banff 评分的肾小球硬化评分一项中，穿刺标本得分高于解剖标本，其他评分结果两者均不存在差异。一直以来对于穿刺活检标本是否可以真实反映肾脏病变情况的争论始终较大，Oberholzer等［18］认为穿刺活检标本足以准确分析肾脏肾小管萎缩和间质纤维化程度，但是Girolami 等［13］利用弃用肾脏做对比实验后认为活检结果不能代替整个器官病变程度，活检标本可能会高估肾脏病变的程度。我们的结果更倾向于穿刺标本可以反映供肾真实质量。虽然穿刺标本肾小球硬化率、小动脉内膜增厚和透明样本比例高于解剖标本，但是2 种标本的评分没有差异，而穿刺标本中肾小球和小动脉病变比例高可能与穿刺标本中可观察到的肾小球和小动脉数量较少有关。这一结果也与Muruve 等［19］的实验结论一致。

由于穿刺标本面积小于解剖标本，所以两者肾小球和小动脉数量并没有可比性。因此我们计算单位面积下2 种标本的肾小球和小动脉数量。有趣的是，穿刺标本在单位面积下肾小球数量少于解剖标本，但是小动脉数量高于解剖标本。肾实质可以分为皮质和髓质，皮质位于肾实质浅层，其中85%的肾单位位于皮质区域［20］。根据血流方向，肾动脉分为5 级，其中位于肾实质浅层的血管主要是血供末梢的入球小动脉，该段动脉易收到供者年龄等因素的影响［21］，因此，最佳的穿刺效果是穿刺针获取的标本主要为肾皮质及皮髓质交接区域，此时可以观察到更多的肾小球和更多供肾深部的小血管分支。我们的结果说明在取材时，穿刺针进针角度往往过大，穿刺深度过深，导致一部分穿刺针获取的标本为髓质部分，所以在穿刺标本中观察到更少的肾小球和更多的小动脉。因此，该结果也提示今后在进行穿刺取材时应适当减小进针角度。

本实验中，我们探究了不同部位取材对供肾评估的影响以及目前穿刺活检取材的问题。但是由于研究标本量较少，今后还需要扩大标本量进行进一步研究，另外今后也可以通过计算明确最佳穿刺角度，从而为医生取材提供数据参考。