二甲双胍通过LncRNA-H19抑制非小细胞肺癌A549迁移及侵袭的机制研究

刘凯 李勃 吴向天 明怀德

非小细胞肺癌占肺癌组织学亚型中的85%。肺癌转移是影响其预后的关键因素之一，进一步研究转移相关机制则有利于改善肺癌病人的预后。二甲双胍是最常用的2型糖尿病一线治疗药物，因其具有潜在的抗癌作用越来越受到学界的关注。有研究表明，二甲双胍与标准一线化疗联合可显著改善非糖尿病晚期非小细胞肺癌病人的预后[1]。LncRNA参与了众多生物学过程，包括细胞增殖和肿瘤转移[2]。LncRNA-H19具有促进肿瘤的作用，本研究探讨二甲双胍是否通过LncRNA-H19发挥抑制非小细胞肺癌A549的作用。

材料与方法

一、材料

1. 细胞株:A549人非小细胞肺癌细胞株购于美国ATCC细胞库。

2.细胞实验相关试剂:DMEM细胞培养基、胎牛血清(FBS)、0.25%胰蛋白酶、100 U/ml青霉素+链霉素、lipofactemine3000、TRIzol试剂均购自美国Invitrogen公司；基质胶购自于康宁公司；引物合成项目购自上海生工生物工程股份有限公司；RNA反转录试剂盒(PrimeScript RT Reagent Kit)、real-time PCR试剂盒(SYBR Premix Ex Taq Ⅱ)均购自日本Takara公司；pc-H19过表达质粒购自上海吉玛制药技术有限公司。

二、方法

1.细胞培养： A549人非小细胞肺癌细胞株培养于含双抗的10% FBS的DMEM培养基中。

2.过表达质粒转染：本研究所涉及pcH19过表达质粒由吉玛基因设计、合成、验证。使用Lipofactemine3000进行转染，48 小时后进行后续实验。

3.细胞RNA抽提及qRT -PCR ： 使用TRIzol法提取细胞RNA并检测浓度，反转录为cDNA后进一步进行qRT-PCR。qRT-PCR程序使用产品说明书推荐程序。本实验涉及引物序列如下：U6(人)，F-5'-GCTTCGGCAGCACATATACTA-3'，R-5'-CGAATTTGCGTGTCATCCTT-3'；LncRNA-H19(人)，F-5'-TGCTGCACTTTACAACCACTG-3'，R-5'-ATGGTGTCTTTGATGTTGGGC-3'。以U6表达量作为内参，并使用2-△△Ct值计算靶基因的相对表达量。

4.细胞迁移及侵袭实验：将基质胶铺于Transwell的上层小室中，成膜后进行侵袭实验(迁移实验无需使用基质胶)。上层小室中加入约5×104个细胞，下层小室加入含20% FBS的完全培养基。培养48小时后取出小室，经PBS清洗、4%多聚甲醛固定后使用结晶紫染色，棉签拭去上层未迁移细胞后显微镜观察拍摄，统计各组细胞迁移、侵袭的情况。

三、统计学方法

结果

1.二甲双胍抑制A549细胞的迁移及侵袭能力:Transwell迁移的结果与对照组结果比较见图1A。 40 mM二甲双胍处理A549细胞48小时可显著抑制肿瘤细胞的迁移能力，差异有统计学意义(P<0.05)；Transwell侵袭实验的结果与对照组比较见图1B。 结果提示,40 mM二甲双胍同样可以抑制A549细胞的侵袭能力，差异有统计学意义(P<0.05)。

A:Transwell迁移的结果与对照组结果比较。B:Transwell侵袭实验的结果与对照组结果比较注：使用Transwell实验分别验证二甲双胍对于A549细胞迁移及侵袭能力的抑制作用。aP<0.05。Ctrl为对照组，进行t检验图1 二甲双胍抑制A549细胞的迁移及侵袭能力

2.二甲双胍抑制LncRNA-H19的表达:qRT-PCR结果显示，40 mM二甲双胍处理48小时可以显著抑制A549细胞中LncRNA-H19的表达量,差异有统计学意义(P<0.05)。转染过表达载体48小时后可显著提升A549细胞中H19的表达量，差异有统计学意义(P<0.05)，差异有统计学意义(P<0.05)。进一步使用二甲双胍处理可以抑制H19过表达载体的作用，降低肺癌细胞系中H19的表达，差异有统计学意义(P<0.05)。

注：使用qPCR分别检测二甲双胍抑制A549细胞内H19表达的作用、pc-H19的过表达效能以及二甲双胍对于pc-H19过表达作用的拮抗效果。aP<0.05；bP<0.01；cP<0.001。Ctrl vs MET，Ctrl vs pc-H19，pc-H19 vs pc-H19+MET，分别进行t检验图2 二甲双胍抑制LncRNA-H19的表达

3.二甲双胍通过LncRNA-H19抑制A549迁移及侵袭:Transwell迁移的结果与对照组结果比较见图3A，MET可以显著抑制A549细胞的迁移能力，差异有统计学意义(P<0.05)。而pc-H19转染后可以显著促进A549细胞的迁移能力(P<0.05,图3A)，而MET可以显著抑制过表达H19的促进肿瘤迁移的能力(P<0.05,图3A)。Transwell侵袭实验也得出相同趋势的结论，即MET可能通过拮抗H19发挥抑制A549侵袭能力的作用(P<0.05,图3B)。

注：使用Transwell实验分别检测过表达LncRNA-H19、过表达H19+二甲双胍处理48小时对于A549细胞迁移能力(A)及侵袭能力(B)的影响。aP<0.01；bP<0.001；cP<0.001。使用单因素方差分析。图3 二甲双胍通过LncRNA-H19抑制A549迁移及侵袭

讨论

本研究表明，二甲双胍在体外实验中具有抑制非小细胞肺癌细胞系A549迁移及侵袭的作用，可能与抑制LncRNA-H19的表达有关。二甲双胍广泛应用于糖尿病的临床治疗，越来越多的临床研究支持二甲双胍具有一定的抗癌作用。研究发现，与2型糖尿病病人相比，不合并2型糖尿病的非小细胞肺癌病人的生存率更佳[3]。研究人员进一步发现，使用二甲双胍是非小细胞肺癌合并2型糖尿病病人具有良好预后的独立因素之一[3]。除合并2型糖尿病的肺癌病人外，一项荟萃分析表明，二甲双胍暴露与肺癌病人生存率提高显著相关[4]。关于二甲双胍抑制肿瘤、改善预后的机制研究主要集中于调节细胞凋亡和自噬，影响细胞增殖和死亡[5]，增强免疫细胞的抗癌活性[6]，抑制癌细胞的上皮-间充质转化和转移[7]，以及改善肺癌病人的耐药性并提高疗效[8]。这些发现均支持了二甲双胍对非小细胞肺癌的潜在治疗效果。

LncRNA-H19具有促癌作用，多种肿瘤中均表达上调。在肺癌组织中H19也呈现上调趋势，促进肺癌细胞发生上皮-间充质转化及转移[9-10]。H19可通过多种途径促进肿瘤的增殖及转移能力，Gao等[9]发现，H19可通过调节肺癌细胞中CDH1启动子的甲基化表达水平，调控肿瘤细胞的上皮-间充质转化过程、增殖、肿瘤干细胞特性、抗凋亡、迁移以及侵袭能力。Liao等[10]发现，H19可促进肺癌细胞中间充质标志物(波形蛋白和N-钙黏蛋白)的表达，降低了上皮标志物(E-钙黏蛋白)的表达，从而增强了癌细胞的侵袭能力。另外一项荟萃分析发现，H19的多态性(rs217727和rs2839698)与肺癌发生风险增加之间存在关联[11]，这表明H19的异常表达可促进癌症进展。一项以中国人群为基础的病例对照研究显示，H19基因的4个单核苷酸多态性(rs2067051、rs217727、rs2839698和rs4929984)是中国非小细胞肺癌人群中最常见的基因型。其中rs2067051和rs217727多态性对非小细胞肺癌的易感性有潜在影响[12]。Gupta等[13]报道，从痰样本中获得的三个LncRNAs(SNHG1、H19和HOTAIR)被证明是诊断鳞状细胞癌的高度敏感的生物标志物组合。这些结果均显示了H19在肺癌发生、诊断、治疗中的重要作用。这些结果进一步支持我们的发现，LncRNA-H19/β-catenin通路是二甲双胍治疗肺癌的潜在靶点之一。今后的研究将进一步深入挖掘LncRNA-H19促进非小细胞肺癌增殖及转移的机制，发现下游相关靶基因并进一步研究二甲双胍通过H19发挥抑癌作用的分子机制。