不同接种方式下番茄溃疡病病原菌的致病效果比较

纪雨微 李梓嫣 邓硕真 汪玉清

(中国农业大学 园艺学院/北京市设施蔬菜生长发育调控重点实验室，北京 100193)

番茄是世界上重要的蔬菜作物，也是我国各地普遍栽培的主要蔬菜品种。番茄细菌性溃疡病(Bacterial canker of tomato)常称作番茄溃疡病，是由密执安棒形杆菌(

Clavibacter

michiganesis

)引起的一种常见病害，该病害导致的产量损失最高可达80%以上。番茄溃疡病最早于1909年在美国密西根州发生，随后蔓延到世界上多个番茄种植地区，遍布于北美洲、欧洲、亚洲、非洲和大洋洲等五大洲的80多个国家。我国有关番茄溃疡病的记载始于1954年，俞大绂等在大连某市场上发现了2个有类似番茄溃疡病症状的番茄果实，但是直到1985年刘泮华等才在北京成功分离并鉴定为溃疡病菌。之后该病在我国迅速蔓延，目前中国大陆地区除了西藏和陕西等少数几个省、市及自治区外其他省区及自治区均有报道。番茄溃疡病的发生对我国的番茄生产带来了很大的影响和经济损失，急需有效的防控措施改变目前日益严重的发展形势。

目前为止，国内外尚无防治番茄溃疡病的有效方法，目前采取的防治措施主要有化学防治和田间农业管理防治。这些措施均局限于在一定程度上控制病害的发生与蔓延，不能有效地根治。抗病品种的应用是防控番茄溃疡病最简便、经济和有效的途径。国内外已经鉴定到一些具有抗性的番茄野生种及来自它们的栽培种衍生系材料，但是至今还没有带有抗性的商业品种上市。遗传学研究表明，番茄溃疡病的抗性呈多基因位点控制的数量遗传，但目前尚未有抗性位点或基因被克隆。因此需要继续利用抗性种质资源构建遗传分离群体进行抗性遗传研究，定位并克隆抗性基因。而建立稳定又准确的人工接种鉴定体系是筛选抗病种质资源和遗传群体交换单株以及进行药剂控制技术研究的前提。国内外已报道的人工接种方法有喷雾法、剪顶法、真空渗透法和注射法。番茄溃疡病是一种侵染维管束的系统性病害，最终会引起植株全株萎蔫死亡，因而人工接种植株发病后，植株死亡对于后续的性状分析及留种后代观察表型极为不利，尤其是在遗传群体的交换单株鉴定过程中。因此，需要寻找1种既能区分抗感材料发病差异，又能在一定时期内植株不会死亡的接种方式。本研究拟通过采用剪顶法、喷雾法、复叶柄注射法、茎顶端注射法和茎基部注射法这5种常见的人工接种方式，分析不同接种方式引起的发病率和死亡率，并比较病原菌在番茄抗感材料茎内部的传播规律，以期为番茄抗溃疡病材料鉴定与筛选提供合适的人工接种方式。

1 材料与方法

1.1 试验材料

感病番茄：品种‘OH88119’、‘Ailsa Craig’(AC)和栽培番茄LA3172；抗病番茄：栽培番茄IBL2353和野生多毛番茄LA407。

供试菌株：

Clavibacter

michiganesis

病原菌GS12102菌株采集于甘肃省，由中国农业大学罗来鑫老师提供，经毒性检测鉴定为具有高致病力毒性菌株。

1.2 试验方法

1

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2

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1

接种体活化制备

所用材料均需灭菌。配制LB固体培养基，将菌株均匀涂抹在培养基表面，然后置于28 ℃生化培养箱倒置培养，约48～72 h长出黄色菌层后收集。用无菌的1 mmol/L的MgSO溶液重悬至OD为0.5，备用。

1

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2

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2

5种人工接种方式

准备浓度为3×10cfu/mL的菌悬液，每种接种方式设3次重复，每次重复为20株。具体方法如下：

剪顶法：取长势均匀的2～3叶龄幼苗，将14 cm手术剪的前端蘸取菌悬液，在茎顶部新叶处将主茎顶部剪断。

喷雾法：取长势均匀的4～5叶龄幼苗，喷雾接种前2～3 h对待接种植株进行喷水。之后将菌悬液置于压力喷壶中，对整体植株(包括叶片背面)喷雾接种。喷菌后，套袋保湿3～4 d。

茎基部注射法：取长势均匀的4～5叶龄幼苗，在茎基部2片子叶节之间用1 mL注射器对茎表面注射接种，每株大约接种200 μL。

茎顶端注射法：取长势均匀的4～5叶龄幼苗，在茎顶端生长点与上部第1片真叶之间用1 mL注射器对茎表面注射接种, 每株大约接种200 μL。

复叶柄接种法：取长势均匀的4～5叶龄幼苗，在幼苗植株下部第2或第3叶序的复叶叶柄处用1 mL注射器注射接种，每株大约接种200 μL。

所有接种方式均采用1 mmol/L的MgSO溶液作为对照。接种后，将番茄幼苗放入人工培养箱保湿培养(相对湿度为90%～100%)48 h后，移至温室正常管理。喷雾接种的植株移至温室后继续套袋2 d。温室培养条件：白天25～28 ℃，晚上18～22 ℃，平均湿度80%左右。

1

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2

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3

接种后番茄体内活菌的测量

接种后0 d，分别取距离注射孔向下3 cm和向上6 cm处茎部组织研磨作为初始浓度对照；接种后10 d茎基部注射植株取样位置为注射孔向上6 cm处，茎顶端注射植株取样位置为注射孔向下3 cm处；接种后20 d，茎基部注射植株取样位置为注射孔向上12 cm处，茎顶端注射植株取样位置为注射孔向下9 cm处。取样前，用棉花球蘸取75%消毒酒精轻轻擦拭取样部位，用灭菌刀片在取样部位横切茎部，每株取样量0.05 g。样品研磨液重悬后稀释至10倍涂于平板，3～4 d后统计平板菌落数。之后将菌落浓度换算成log值进行比较。

菌落浓度

1

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2

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4

接种后植株表型鉴定

接种3～4 d后开始调查植株发病情况，参考Coaker等单个接种植株的病情分级方法调查叶片及植株整株发病情况。番茄溃疡病分级标准：将病情分为0～5级(0级为无症状，5级为整株复叶均萎蔫至死亡)，单株病情指数IDRS(Individual disease rating score)对应病级分别为：IDRS为0级：叶片无病斑萎蔫，茎部注射孔无病斑或开裂产生；IDRS为1级：0<叶片萎蔫比例≤0.2，注射孔无病斑或开裂产生；IDRS为2级：0.2<叶片萎蔫比例≤0.4，注射孔有轻微程度开裂；IDRS为3级：0.4<叶片萎蔫比例≤0.6，注射孔有明显开裂或菱形病斑；IDRS为4级：0.6<叶片萎蔫比例≤0.8，注射孔有较大开裂或菱形病斑；IDRS为5级：0.8<叶片萎蔫比例≤1.0，整株复叶枯萎至死亡，茎部注射孔严重开裂或折断。

病情指数计算方法：

病情指数

1

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2

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5

数据分析采用Microsoft 2019和SPSS 25.0统计软件分析实验数据，利用ANOVA法进行差异显著性检验(

P

<0.05)。

2 结果与分析

2.1 5种接种方式下番茄植株溃疡病的发病情况

采用5种接种方式对感病材料‘OH88119’接菌后，进行植株病情调查，发现不同接种方式下番茄溃疡病起始发病时间(接种后天数)和病情严重程度不同(图1和表1)。剪顶法接种后4 d多数植株开始出现小叶萎蔫，10 d开始有少量植株整株萎蔫死亡，至40 d时接种植株死亡率高达96.7%(图1(a))。喷雾法接种方式下病原菌引起植株发病较慢，14 d开始有少量植株复叶上1～2片小叶有萎蔫或边缘焦枯症状，至30 d发病率仅为58.3%，40 d死株率仅为5.0%(图1(b))。复叶柄接种方式下发病起始时间表现中等，病情指数和死株率均较低(图1(c))。茎顶端注射接种方式下7 d开始发病(图1(d))，30 d时发病率为100.0%。茎基部注射接种时病原菌引起发病起始时间较早，5 d开始有一些植株下部复叶萎蔫，注射孔变大；至30 d时全部发病，且病情指数(81.5)仅次于剪顶法，但是死株率远低于剪顶法(图1(e))。

剪顶法和茎部注射接种法番茄溃疡病发病率均高达100.0%，平均病情指数均在75.0以上，诱发发病效果显著高于喷雾法和复叶柄注射法。但是剪顶法死亡率最高，在30 d时已达80.0%左右，40 d时接近于全部死亡，不利于后续的结构或遗传分析及留种。综合各项指标，茎顶端注射和茎基部注射法比较适合于番茄溃疡病的致病性评价。

2.2 茎部注射接种方式下溃疡病病原菌在番茄内部的传播规律

根据上述试验结果以及前人对溃疡病菌在番茄体内沿木质部向上运输的结论，本研究继续在番茄不同抗感材料上对茎顶端和茎基部注射接种法进行了致病效果的比较。选取感病材料‘OH88119’和抗病材料LA407同时进行2种方式接种，比较病情发展情况。10 d后茎基部注射方式下感病材料在距离注射点6 cm处内部溃疡病菌浓度已经达到9.03，极显著高于抗病材料；而20 d时在距离注射点12 cm处病原菌浓度高达9.28，极显著高于抗病材料，说明病原菌至少已经向上传播至12 cm处并且在此处有大量增殖(图2(a))。茎顶端注射方式下病原菌沿维管束向下扩散，10 d后在距离注射点更近的3 cm处活菌浓度与茎基部注射的6 cm处相似，抗病材料内部活菌浓度低于原始注射浓度；20 d后距离注射点9 cm处感病材料内部活菌浓度为8.14，低于茎基部注射后同样时间更远距离12 cm处的浓度，而抗病材料则降至更低为5.53，表明病原菌没有在此处增殖(图2(b))。以上表明，茎基部注射方式下病原菌的传播速度远高于茎顶端注射方式，茎基部注射方式更有利于番茄植株发病。

(a)剪顶法接种30 d后整株萎蔫死亡；(b)喷雾法接种40 d后下部叶片萎蔫；(c)复叶柄注射接种30 d后注射叶片和相邻叶片萎蔫；(d)茎顶端注射法接种30 d后整株单侧叶片萎蔫；(e) 茎基部注射法接种30 d后整株单侧叶片萎蔫，下部叶片蔫黄脱落。

表1 不同接种方式下番茄溃疡病发病情况
Table 1 The disease phenotype traits induced by different inoculation methods

接种方式Inoculation method接种后发病时间/dDays of diseaseemerging接种植株数/株No. ofinoculatedseedlings平均发病率/%Averageincidence 平均病情指数Averageindex平均死株率/%Averagedeath rate剪顶法Top-pruning460100.096.5 aA96.7喷雾法Spraying146058.334.3 dD5.0复叶柄注射法Complex leafstalk injection66090.047.3 cC8.3茎顶端注射法Stem top injection760100.077.7 bB35.0茎基部注射法Stem base injection560100.081.5 bB45.3

注：平均发病率和平均病情指数统计时间为接种后30 d，平均死株率统计时间为接种后40 d。同列数据不同小写字母表示0.05水平下差异显著，不同大写字母表示0.01水平下差异显著。

Note: The statistical time of average incidence and disease index were 30 days post inoculation; The statistical time of average death rate was 40 days post inoculation. Within the Average index column, different lowercase letters represent significant differences between two inoculation methods (<0.05), different capital letters represent very significant differences between two inoculation methods (<0.01).

(a)感病材料‘OH88119’和抗病材料LA407幼苗茎基部注射接种后10 d时距离接种点6 cm处和接种20 d后距离接种点12 cm处体内活菌数量；(b)感病材料‘OH88119’和抗病材料LA407幼苗茎顶端注射接种后10 d距离接种点3 cm处和接种20 d后距离接种点9 cm处体内活菌数量。**表示二者差异极显著(P<0.01)。

2.3 茎基部注射法接种在番茄溃疡病抗感材料上的致病情况

基于前两部分的试验结果，可以得出：使用茎基部注射法进行人工接种最适于番茄溃疡病抗感材料的鉴定与筛选。接下来同时对3份感病材料和2份抗病材料进行茎基部注射接种，观测比较溃疡病发病情况和体内活菌生长情况(表2)。接种后发现，3份感病材料起始发病时间均在第5～7天，均早于抗病材料的第10～12天；而且3份感病材料到30 d的发病率均到了100.0%，病情指数均在80.0左右；而2份抗病材料的病情指数在30.0左右，说明此种接种方式能很好地区分抗感材料。

为了验证茎基部注射法同样适用于遗传群体的表型分析，我们对抗感亲本构建的F群体(179株)和杂合F株得到的F群体(748株)这2份遗传群体使用茎基部注射法进行鉴定分析。结果表明，F群体中基因型与感病亲本一致的纯合单株(38株)接种后40 d时植株病级在2级以上表型感病的有38株，发病率达100.0%，整体病情指数为84.7；基因型与抗病亲本一致的纯合单株(44株)接种后病级在2级及以下表型为抗病的有41株，基因型与表型一致度为93.2%；在F群体的纯合感病基因型(182株)中，整体病情指数为80.2，病级在2级以上的有180株，基因型与表型一致度为98.9%；F群体的纯合抗病基因型178株，病情指数为32.6，与另外2份抗病材料病指无明显差异。2份群体的基因型纯合单株病级频率分布结果见图3。上述结果表明，茎基部注射法适用于番茄溃疡病不同抗感材料及遗传分离群体抗感单株的鉴定与筛选。

3 讨论与结论

研究发现对番茄溃疡病的抗性主要来源于4种野生种：

S.

pimpinellifolium

、

S.

peruvianum

、

S.

habrochaites

、

S.

parviflorum

及来源于它们的栽培种衍生系。在将野生抗源向栽培种导入过程中，建立稳定的致病评价体系是筛选抗病种质资源的前提。因此对材料人工接种进行抗感表型鉴定是十分重要的一个环节，研究者们尝试了不同的人工接种方式以达到最好的鉴定区分效果。2005年罗来鑫等使用打顶(剪顶)法、剪叶法、茎上针刺法和浸根法等4种方式侵染番茄幼苗，其中打顶法接种后植株发病率达到87.5%～100.0%，病情指数在不同品种上的范围为43.75～82.29；2018年史娜艳等通过茎上注射法、浸根法、剪顶法和拌土法来侵染番茄，发现剪顶法和茎上注射法接种效果最好，二者发病率均达到100.0%，病情指数分别为91.0和90.0。本试验也表明剪顶法接种后番茄溃疡病发病率为100.0%，病情指数在30 d时达到96.5，与前人研究结果相似。但是，上述2个研究表型分析仅调查至接菌后14～21 d，当本试验继续观察至30～40 d时，发现剪顶法的植株死亡率高达96.7%，无法进行后续的显微结构或遗传分析及繁收种子。同时本试验使用茎部注射法群体发病率也高达100.0%，病情指数达到80.0左右，说明致病效果并无异于剪顶法。因此，在保证致病效果的条件下，当进行抗病品种鉴定和筛选时需要更久时间(大于21 d)来观测表型或繁收留种，相比于高死亡率的剪顶法茎部注射法更适用。

表2 茎基部注射接种方式下不同番茄材料溃疡病发病情况
Table 2 The disease incidence of different tomato materials in the stem base injection method

材料名称Line name接种后发病时间/dThe time ofdisease emerging群体数量/株No. of plantpopulation病情指数Diseaseindex感病材料‘OH88119’Susceptible ‘OH88119’56083.8感病材料LA3172Susceptible LA317266084.5感病材料‘Ailsa Craig’Susceptible ‘Ailsa Craig’76079.8F2群体中感病基因型纯合株Homozygous individual with susceptible genotype in F2 populations53884.7F3群体中感病基因型纯合株Homozygous individual with susceptible genotype in F3 populations518280.2抗病材料 IBL2353Resistant material IBL2353106031.8野生抗病材料LA407Wild resistant material LA407126029.7F2群体中抗病基因型纯合株Homozygous individual with resistant genotype in F2 populations104435.5F3群体中抗病基因型纯合株Homozygous individual with resistant genotype in F3 populations1017832.6

图3 F2和F3群体内基因型纯合单株病级频率分布图Fig.3 Frequency distribution histogram on disease score of homozygous individuals in F2 and F3populations

以往研究认为番茄溃疡病菌在植株体内是随木质部水流向上部传播，本研究发现该菌在番茄体内既可以沿维管束向茎的上部传播，也可以通过维管束向茎的下部传播，但是向下的扩散速度显著低于向上的扩散速度。这种现象可能需要进一步的细胞学研究，以确定溃疡病菌是否进入了韧皮部系统，并随着韧皮部液流向下传播。茎顶端注射接种方式可以达到较好的致病效果，但是结合内部病原细菌的传播速度及人工操作的便利性(茎顶端直径细易折)考虑，采用茎基部子叶节处注射接种具有最佳效果。国外很多关于番茄溃疡病的研究大多数采用了茎基部注射法，说明这种方法致病效果真实可靠。而且本试验数据表明，茎基部注射法群体发病率达到100.0%，感病材料病情指数达到80.0左右，抗病材料及群体病情指数在30.0左右；感病群体死亡率约45.0%，抗病群体死亡率很低，为3.0%～8.3%，表明这种方法可以很好地区分番茄植株对溃疡病的抗感表型，并且能够保存植株进行后续实验及留种。前人尚未有剪顶法、喷雾法、茎基部注射法、茎顶端注射法和复叶柄注射法这5种不同接种方式同时进行详尽比较试验的报道，本研究经过大量植株的人工接种及致病效果分析，从这5种人工接种方式中筛选到茎基部注射的接种方式适用于对不同番茄材料及遗传群体的溃疡病抗性鉴定，结果具有新颖性，并且这种接种方式效果稳定，操作简单，对日后筛选抗溃疡病的番茄材料及培育抗性品种具有积极意义。