不同硒形态对镉胁迫下油菜镉亚细胞分布、化学形态及硒累积的影响

张 立， 王 杰

(1.怀化职业技术学院，湖南怀化 418000； 2.湖南粮安科技股份有限公司，湖南邵阳 422008)

镉(Cd)是一种在农田土壤中广泛存在的重金属元素，Cd具有高移动性、高毒害性以及不可生物降解等特性，且研究发现，Cd对植物光合作用、养分吸收及生理代谢具有显著影响，低浓度下Cd可诱导植物活性氧(ROS)累积造成氧化应激损伤，从而导致植株发育迟缓，而高Cd浓度下植物可能会直接死亡，目前土壤Cd污染已成为威胁农作物安全生产的全球问题。油菜(L.)作为最具代表性的十字花科芸薹属植物，是我国种植面积最广的油料作物，Cd胁迫可导致油菜籽产量锐减，菜籽油是居民日常的膳食辅料，超过每日摄入量限制的Cd含量会对人类健康造成危害。因此，降低油菜的Cd累积对保护人们免受Cd的威胁具有重要意义。

硒(Se)是人类和动物所必需的微量营养元素，尽管Se对高等植物来说不是必需的，但大量研究表明，一定剂量的Se对植物生长和提高非生物胁迫耐受性具有积极影响。近年来，Se在减轻植物重金属(例如Cd)毒性方面的作用已越来越受到关注。周健等研究表明，外源硒代甲硫氨酸、硒酸盐[Se(Ⅵ)]和亚硒酸盐[Se(Ⅳ)]作为3种形态的硒源皆可有效提高小油菜的抗氧化酶活性，激活谷胱甘肽代谢，从而降低Cd胁迫对小油菜的应激损伤。徐境懋等研究发现，亚硒酸盐[Se(Ⅳ)]处理可降低细胞可溶物质组分和细胞器组分的Cd含量，改变根系Cd的亚细胞分布，从而减少Cd向茎叶的转运，降低地上部的膜脂过氧化程度。Lin等研究表明，外源Se(Ⅳ)可通过增加叶绿素含量和提高抗氧化活性来减少辣椒中的镉积累，且Se有利于Cd胁迫下细胞膜和叶绿体结构的恢复和重建。上述研究表明，Cd胁迫下不同硒形态尤其是Se(Ⅳ)和Se(Ⅵ)对植物具有良好的解毒作用。

土壤中存在不同形态的Se源，Se(Ⅳ)是淹水环境的主要形式，Se(Ⅵ)主要存在于碱性或通气状况良好的环境中。有机形式的Se是土壤硒的主要组成部分，与N、P等养分的有机形态不同，有机硒容易被植物根系吸收，研究发现小麦、油菜对硒代甲硫氨酸(SeMet)的吸收率是硒(Ⅵ)或硒(Ⅳ)的10～20倍。此外，随着农业技术发展，通过生物或非生物途径还原硒氧阴离子形成的纳米级硒元素(SeNPs)已越来越多的应用于农业生产。目前已知Se(Ⅳ)、Se(Ⅵ)、SeMet及SeNPs皆可被植物吸收，且关于Se对植物Cd吸收和转运的影响已有较多报道，然而关于不同Se形态对重金属胁迫的效果尚不清楚。基于此，本研究通过沙培试验探索4种Se形态对油菜Cd累积、化学形态及生理特性的影响。

1 材料与方法

1.1 供试材料

试验于2021年3—5月在湖南粮安科技园(27°14′28″N，110°22′48″E)进行。供试油菜品种为中双11，种子购自湖南粮安科技股份有限公司。种子采用5%HO进行表面灭菌5 min，采用蒸馏水冲洗，然后放置于铺满基质的园艺育苗盘中，在光照培养室(光—暗周期为12 h—12 h)中培养15 d。

供试土壤取自湖南省怀化市某电子拆卸区附近废弃的油菜田。将土壤自然风干后采用溴甲烷(CH-Br)对土壤进行化学熏蒸，之后过4 mm网筛备用。供试土壤理化性质如下：有机质含量为28.26 g/kg、全磷含量为1.95 g/kg、碱解氮含量为96.40 mg/kg、速效磷含量为22.18mg/kg、速效钾含量为141.72 mg/kg，pH值为6.27，镉含量为 4.58 mg/kg。根据GB 15618—2018《土壤环境质量 农用地土壤污染风险管控标准(试行)》，当土壤pH值为5.5～6.5时，农田土壤污染Cd风险临界值为0.30 mg/kg，供试土壤Cd超标14.27倍。

供试亚硒酸钠(NaSeO)、硒酸钠(NaSeO)、硒代甲硫氨酸(CHNOSe)均购自北京百灵威科技有限公司；纳米硒(SeNPs)，粒径25～45 nm，购自奥格生物技术(上海)有限公司。供试N、P、K肥分别为分析纯的尿素、磷酸二氢钙、硫酸钾，均购自湖南化学试剂总厂。

1.2 试验设计

试验设置5个处理：对照(CK)，污染土培养；SeNPs，污染土培养中施用纳米硒；Se(Ⅵ)，污染土培养中施用硒酸钠；Se(Ⅳ)，污染土培养中施用亚硒酸钠；SeMet，污染土培养中施用硒代甲硫氨酸。各处理重复3次。上述硒处理皆采用超纯水进行高速搅拌，Se浓度为36 μmol/L。

盆栽装置为桶形塑料制品，每盆装土2.5 kg，将肥料(N=1.0 g，(N) ∶(PO) ∶(KO)=2 ∶1 ∶1)与土壤充分混合，保持70%土壤持水量，平衡6 d。之后每盆移入油菜幼苗3株，待幼苗进入生根期(10 d后)间苗至1株。之后加入相关硒溶液，为避免高剂量的硒对幼苗造成冲击效应，采用多次分施，即每次施入30 mL相应硒溶液，连续 10 d，总量为300 mL。其他管理措施同作物培育方法，盆栽培育时间为38 d。

1.3 样品采集及测定分析

1.3.1 油菜植株生物量、Cd浓度及Se浓度测定 培养38 d后，将油菜植株小心整株取出，将植株地上部、根系分开，105 ℃杀青30 min，70 ℃烘干至恒质量并记录。将烘干的植株进行粉碎处理封装待测，称取0.50 g待测样品，用HNO消解2 min，之后加入浓盐酸进行酸解萃取，借助电感耦合等离子体光谱仪(ICAPQc，赛默飞世尔科技公司)采用电感耦合等离子体质谱法测定样品中的Cd、Se浓度。

1.3.2 植株Cd亚细胞分布、Cd化学形态测定 Cd的亚细胞分布采用差速离心法分离测定，分为细胞壁、细胞器、细胞膜和可溶性部分，相关方法参考闫秀秀等所述略作修改。即准确称取0.50 g新鲜油菜植株样品，并用在4 ℃环境下预冷的40 mL混合提取液[250 mmol/L蔗糖、1 mmol/L二硫代甲状腺素醇(DTT)、50mmol/L三羟甲基氨基甲烷盐酸盐，pH值为7.5]速研磨提取样品，将匀浆采用 80 μm 孔径的有机膜过滤，残留滤渣记为细胞壁组分。将所得滤液在 3 000 r/min 离心30 min，沉淀物即为细胞器组分；随后上清液以15 000 r/min进一步离心30 min后，上清液溶液、沉淀物分别为可溶性组分、细胞膜组分。

Cd不同化学形态分为乙醇提取态、水提取态、氯化钠提取态、醋酸提取态、盐酸提取态及残渣提取态，上述提取分离参考Fu等所述采用逐步提取法测定，使用电感耦合等离子体质谱仪测量每个提取步骤中获得的Cd浓度。

1.3.3 植株光合色素测定 叶绿素、类胡萝卜素总量皆采用丙酮-乙醇混合浸提，采用紫外分光光度法分别在650、470 nm处测定，具体步骤参照李合生所述。

1.4 数据处理与统计分析

采用Excel 2013进行数据整理，采用SPSS 19.0进行试验数据统计分析(=0.05)，采用Origin 9进行图形绘制。

2 结果与分析

2.1 不同硒形态对镉胁迫下油菜生物量累积及色素含量的影响

由图1-a可知，地上部干物质累积中，与CK相比，硒处理[SeNPs、Se(Ⅵ)、Se(Ⅳ)、SeMet]变幅-35.43%～75.39%，其中Se(Ⅵ)处理累积量最低，显著小于其他处理；以Se(Ⅳ)处理累积量最高，SeMet处理其次，二者间差异显著，同时CK、SeNPs、Se(Ⅵ)处理较Se(Ⅳ)和SeMet处理分别显著降低42.98%、45.12%、63.19%和28.94%、31.61%、54.12%。由图1-b可知，各处理根系干物质累积量表现为Se(Ⅵ)

2.2 不同硒形态对镉胁迫下油菜硒累积的影响

由图2-a可知，各处理地上部Se浓度表现为CK

2.3 不同硒形态对镉胁迫下油菜镉累积及转运的影响

由图3-a可知，根系Cd浓度皆整体大于地上部。地上部Cd浓度中，与CK处理相比，硒处理[SeNPs、Se(Ⅵ)、Se(Ⅳ)、SeMet]显著降低32.94%～42.92%，硒处理中，以SeMet处理Cd浓度最低，其显著低于SeNPs、Se(Ⅵ)、Se(Ⅳ)处理，此外，后三者处理间差异较小且差异不显著；根系Cd浓度中，各处理呈SeMet

2.4 不同硒形态对镉胁迫下油菜镉亚细胞分布的影响

由图4可知，使用差异离心法将植物亚细胞Cd组分分为4个部分：细胞壁、细胞器、细胞膜和可溶性部分。各处理不同组分中Cd累积比例差距较大，在根系中，CK处理中的Cd主要分布于细胞壁(49.91%)和可溶性部分(40.15%)，一小部分分布于细胞器(2.18%)和细胞膜(7.76%)中；同时，在硒处理[SeNPs、Se(Ⅵ)、Se(Ⅳ)、SeMet]中，大部分Cd则存在于可溶性部分(47.51%～58.73%)中，这意味着硒处理下使Cd主要分布于可溶性部分，其中SeMet处理可溶性部分的Cd比例最高，较CK处理增加18.58%。

Cd在地上部中的亚细胞分布规律与根系趋于一致。由图4可知，CK处理的油菜植株中Cd在细胞壁和可溶性部分中的比例较高，其中CK处理细胞壁比例高于SeNPs处理、Se(Ⅳ)处理和SeMet处理；而在可溶性组分中，硒处理的比例皆大于CK处理。然而，对于根系和地上部的Cd亚细胞分布，CK处理和各硒处理[SeNPs、Se(Ⅵ)、Se(Ⅳ)、SeMet]之间，细胞器和细胞膜中Cd比例波动较小。

2.5 不同硒形态对镉胁迫下油菜镉化学形态组成的影响

Cd在根系中的化学形态如图5所示，各处理中的醋酸提取态和氯化钠提取态的Cd形态在根系中占据主要地位，两者Cd化学形态分别占总Cd累积量的20.17%～23.18%和17.35%～31.86%，而残渣提取态的化学形态比例整体较低(9.05%～12.65%)。根系中，CK处理的水提取态的Cd占总Cd的19.09%，均高于硒处理(7.25%～13.77%)；而盐酸提取态和乙醇提取态的Cd化学形态分别以 Se(Ⅵ) 处理(16.67%)、CK处理(20.63%)最高。

在地上部中，各处理的Cd化学形态规律与根系趋势相似。即氯化钠提取态和醋酸提取态的Cd组分在地上部中也占据主导地位，分别占总Cd含量的23.09%～38.61%和20.67%～26.96%。此外，在所有形式的硒处理中，氯化钠提取态和盐酸提取态的Cd比例均高于CK处理，而硒处理的乙醇提取态与水提取态Cd比例皆低于CK处理。

3 讨论与结论

土壤Cd污染已成为制约农业安全生产的重要因素，已有研究表明，外源施用Se可有效降低植物对Cd的累积。本研究中，在Cd污染土壤中培养35 d后，与CK处理相比，除Se(Ⅵ)处理外，其他硒处理[SeNPs、Se(Ⅳ)、SeMet]均促进了油菜地上部、根系干物质累积，同时硒处理的叶绿素总量和类胡萝卜素含量整体大于CK处理。叶绿素是光合作用的主要色素，参与光能的吸收、转移、分配以及转化过程，类胡萝卜素是重要的抗氧化剂，逆境环境下两者皆可激发PSⅡ光反应系统的活性从而维持植物养分代谢。Ahmad等研究表明，在重金属胁迫下硒可提高植物叶绿体中的淀粉积累、抑制叶绿体降解，从而维持植株生理代谢。因此，本研究中Cd胁迫下硒可能是通过提高光合色素含量从而保证油菜植株的生长发育。

污染土壤中，Cd容易从土壤转移至植物体内。前人研究表明，外源无机形态Se可降低污染土壤中小白菜、水稻、小麦等作物的Cd累积。本研究中，SeNPs、Se(Ⅳ)和SeMet处理均显著降低了油菜地上部和根系的Cd浓度，并且有机态硒处理(SeMet)效果最佳，而Se(Ⅵ)处理中地上部Cd浓度显著下降，但在根系中没有显著变化。这些结果表明不同硒形态对植株吸收Cd的阻遏能力不同，这可能是因为不同硒形态进入植物体的机制、数量以及在植株体内的同化差异所致。此外，本研究中，所有硒处理均显著降低了Cd转移系数，即亚硒酸钠、硒酸钠、硒代甲硫氨酸及纳米硒4种形态硒皆可有效阻隔Cd向上运动。进一步研究表明，与无机形式的Se相比，有机硒处理(SeMet)的油菜植株硒含量最高；前人研究表明：有机硒是油菜作物吸收的主要硒形态，该研究结果与前人研究结果一致。以往的研究表明，硒主要通过水分吸收途径被植物根系吸收，因此直径越小的硒形态越容易穿过细胞壁，从而到达植株体内，因此植株的纳米硒吸收量最高。然而本研究发现，SeNPs与Se(Ⅵ)的吸收量相当且皆显著小于Se(Ⅳ)、SeMet，这意味着Se直径并不是Se进入根系的先决条件。

在根系中，Cd在不同亚细胞组分比例表现为细胞壁>可溶性部分>细胞膜>细胞器，这种分布模式可能与植物缓解Cd胁迫的相应机制有关。在植物中，细胞壁是阻止Cd进入植物的首道屏障，但细胞壁对Cd的劫持能力有限，当细胞壁饱和后，可溶性部分的谷胱甘肽螯合Cd形成复合物，从而减少对细胞器的损伤。本研究表明，外源硒处理均降低了细胞壁中Cd比例，增加了可溶性部分中镉的比例，这些结果表明，Se可以促进根系细胞壁和液泡螯合Cd；这一发现与Yu等的研究结果一致。Se的化学性质与硫相似，两者皆可能通过刺激植物中GSH(谷胱甘肽)和PC(植物螯合素)的合成来促进Cd螯合。在植物中Cd首先被根系吸收然后转移到地上部，因此植物中存在的Cd形态可直接影响迁移能力和活性。在本研究中，醋酸提取态和氯化钠提取态的Cd比例在油菜植株中占主导地位，该结果与Wang等的研究结论一致。此外，本研究发现，Se的添加降低了根系中乙醇提取态和水提取态Cd的比例。这些结果表明，硒通过抑制根系到地上部的Cd易位来减少地上部中Cd的积累。综上所述，硒增加了Cd在细胞壁和液泡中的螯合，降低了活性Cd的化学形式，从而减少了地上部Cd的积累。