大麻二酚上调BDNF、突触蛋白发挥抗抑郁作用

杨 艳，马滕滕，边宇婧，顾江娜，孙毓媛，温朕勇，谢建平，袁 云,郭 英

作者单位：1昆明医科大学基础医学院，昆明 6500002云南民族大学图书馆，昆明 650000

抑郁症表现为长期心理和生理的低迷状态。全球范围内有3.22亿人患有抑郁症，约占世界人口的4.4%[1]。大麻二酚(cannabidiol，CBD)是药用大麻的主要化学成分之一，无致幻和成瘾性，具有改善疼痛、失眠、成瘾和焦虑等症状的药理作用[2]，但其医用价值尚未被完全开发。CBD可通过调节多种与抑郁症相关的神经递质系统发挥抗抑郁作用[3]，但具体调节哪些与抑郁症治疗相关因子发挥作用，已成为研究者新的关注点。该研究以慢性束缚复制小鼠抑郁模型，通过观察小鼠行为学表现，检测血清中脑源神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor，BDNF)、突触后密度-95蛋白(postsynaptic density protein 95，PSD-95)、突触素(synaptophysin，SYP)、雷帕霉素靶蛋白(target of rapamycin，mTOR)的变化，探究CBD缓解小鼠抑郁症状的作用及可能机制。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器大麻二酚(衡水昊业化工科技有限公司，批号：20191019)；舍曲林(大连辉瑞制药有限公司, 批号：H10980141)；吐温-80(德国BioFroxx公司,批号：20190422)；小鼠BDNF、PSD-95、SYP、mTOR 酶联免疫吸附测定试剂盒(上海酶联生物科技有限公司,批号：20201222-20520A、20201222-22168A、20201222-22084A、20201222-21729A)。多功能酶标仪、低温高速离心机(美国 Thermo Fisher Scientific)；高速匀浆仪(武汉塞维尔生物科技有限公司)。

1.2 实验动物4周龄SPF级ICR小鼠45只，雄性，体质量20～25 g，购于昆明医科大学实验动物学部，生产许可证号：SCXK (滇)K2020-0004。使用正常小鼠饲料饲喂养，饲料购于昆明医科大学实验动物学部；所有实验动物均饲养于(23±2) ℃的恒温恒湿室内，整个实验期间室内通风条件良好，12 h明暗交替。

1.3 方法

1.3.1抑郁样小鼠模型的建立及分组 45只小鼠适应性饲养5 d，旷场实验后，分为5组，每组9只，正常对照组正常进食进水。其余各组以慢性束缚应激复制抑郁模型，具体方法如下：将小鼠置于前后开口的50 ml离心管，前端有12个直径0.5 mm的小孔，水平放置后禁锢12 h(21:00-次日9:00)，保证通风良好，连续7 d，禁锢时小鼠在同一环境中，不予进食进水。

分组及灌胃处理情况如下：正常对照组和模型组给予2%的吐温-80水溶液，阳性对照组给予10 mg/kg舍曲林，CBD低剂量组给予25 mg/kg CBD，CBD高剂量组给予50 mg/kg CBD，溶剂均为2%的吐温-80水溶液。按10 ml/kg体积进行灌胃，在每只小鼠行为学实验前1 h进行。

1.3.2行为学实验

1.3.2.1旷场实验 将小鼠放在50 cm×50 cm的旷场内进行自由活动和探索。SMART 3.0软件观察记录小鼠在旷场内6 min的活动总路程，同时记录小鼠在旷场中央30 cm×30 cm区域中活动的路程和时间，并分析占旷场的总路程、总时间的百分比。

1.3.2.2强迫游泳实验 将小鼠放在直径18 cm、水温(25±2) ℃、深20 cm的玻璃缸中强迫游泳，观察8 min，SMART 3.0软件记录小鼠后6 min不动时间，并分析小鼠的不动时间占总时间的百分比。

1.3.3生化指标检测

1.3.3.1样本采集及制备 行为学实验结束后，各组小鼠心尖取血，处死小鼠取脑置于冰上，迅速取出海马和前额皮层，放入离心管中置于-80 ℃保存备用。以质量比1 ∶9的比例加入PBS溶液，用匀浆机将标本匀浆充分，12 000 r/min离心15 min，取上清液于4 ℃保存备用。

1.3.3.2ELISA方法进行相关指标测定 设置两组标准品孔和空白对照孔，标准品孔各加不同浓度的标准品50 μl。在酶标包被板上待测样品孔中先加样品稀释液40 μl，然后再加待测样品10 μl，每孔加入酶标试剂100 μl，空白孔除外。用封板膜封板后置37 ℃温育60 min。洗涤液洗涤5次后拍干。每孔先后加入显色剂A和显色剂B各50 μl，37 ℃避光显色15 min，加入终止液50 μl。以450 nm波长依序测量各孔的吸光度(optical density, OD)。以标准物的浓度为横坐标，OD值为纵坐标，绘出标准曲线。标准曲线方程式分别为：yBDNF=0.0034x+0.1095(R2=0.9982)、yPSD-95=0.117x+0.0956(R2=0.9989)、ySYP=0.0652x+0.0865(R2=0.9976)、ymTOR=0.0553x+0.0833(R2=0.9998)。

2 结果

2.1 CBD对抑郁样小鼠旷场实验的影响由表1可知，与正常对照组对比，模型组在中央区域活动路程百分比、中央区域活动时间百分比和总路程均明显降低(F=3.522、2.841、2.110,P<0.05)。与模型组相比，CBD低剂量组在中央区域活动路程百分比、中央区域活动时间百分比和总路程均明显升高(P<0.05)。各组小鼠旷场实验活动轨迹见图1。以上结果表明CBD对应激小鼠有明显的抗焦虑作用，并且使小鼠的自发行为也明显增加。

2.2 CBD对抑郁样小鼠强迫游泳实验的影响由表2可知，与正常对照组相比，模型组小鼠的不动时间百分比明显增大(F=3.772,P<0.01)。与模型组相比，CBD低剂量组和阳性对照组不动时间百分比均降低(P<0.05)。以上结果表明CBD对抑郁样小鼠有明显的抗抑郁作用。

表1 CBD对抑郁样小鼠旷场实验的影响

图1 CBD对抑郁样小鼠旷场实验活动轨迹的影响

表2 CBD对抑郁样小鼠强迫游泳实验的影响

2.3 CBD对抑郁样小鼠海马和前额皮层中BDNF浓度的影响由图2可知，在前额皮层，与正常对照组相比，模型组BDNF浓度明显下降(F=2.805,P<0.05)。与模型组相比，CBD低剂量组BDNF浓度明显增高(P<0.01)。在海马组织中，各组之间BDNF浓度均无明显差异。以上结果表明CBD能增加抑郁样小鼠前额皮层BDNF的浓度。

图2 CBD对抑郁样小鼠海马和前额皮层中 BDNF 浓度的影响

2.4 CBD对抑郁样小鼠海马和前额皮层中PSD-95 浓度的影响由图3可知，在前额皮层，与正常对照组相比，模型组PSD-95浓度明显下降(F=8.401,P<0.01)。与模型组相比，CBD低剂量组(P<0.05)和阳性对照组(P<0.01)PSD-95浓度均明显增高，而CBD高剂量组PSD-95浓度有增高趋势(P=0.075)。在海马组织中，各组之间PSD-95浓度均无明显差异。以上结果表明CBD能增加抑郁样小鼠前额皮层PSD-95的浓度。

2.5 CBD对抑郁样小鼠海马和前额皮层中SYP浓度的影响由图4可知，与正常对照组相比，模型组SYP浓度在海马中明显下降(F=9.523,P<0.01)。与模型组相比，CBD低剂量组、CBD高剂量组和阳性对照组在海马中SYP浓度均明显增高(P<0.01)。前额皮层中，与模型组相比，CBD低剂量组SYP浓度增高(F=7.824，P<0.05)。以上结果表明CBD能增加抑郁样小鼠海马和前额皮层SYP的浓度。

图3 CBD对抑郁样小鼠海马和前额皮层中PSD-95 浓度的影响

图4 CBD对抑郁样小鼠海马和前额皮层中SYP浓度的影响

2.6 CBD对抑郁样小鼠海马和前额皮层中mTOR浓度的影响由图5可知，在海马区域，与正常对照组相比，模型组mTOR浓度明显下降(F=13.013,P<0.01)。与模型组相比，CBD低剂量组、高剂量组和阳性对照组mTOR浓度均明显上升(P<0.01)。在前额皮层区域，与正常对照组相比，模型组mTOR浓度降低(F=2.888,P<0.05)。与模型组相比，CBD低剂量组mTOR明显增高(P<0.01)。以上结果表明CBD能增加抑郁样小鼠海马和前额皮层mTOR的浓度。

图5 CBD对抑郁样小鼠海马和前额皮层中 mTOR浓度的影响

3 讨论

抑郁症是遗传、生理、环境等诸多因素参与的精神疾病，发病机制尚不清楚。神经营养缺乏假说认为，抑郁状态下，前额叶皮层和边缘系统萎缩，神经营养因子含量明显减少。CBD作为大麻中不具有精神活性和药物依赖性的成分,安全性相对高，已有较多在神经疾病，如癫痫、阿尔兹海默症、帕金森、焦虑症等方面的研究，但在抗抑郁作用及机制的研究还较少。

本实验使用舍曲林这一抗抑郁药物作为阳性对照，它已被证明可提高突触蛋白水平并促进海马神经元的树突生长[4]。BDNF参与神经可塑性和对应激性神经损伤的修复，其水平的调节已被证明在抑郁症的发病、治疗中发挥重要作用[5]。PSD-95和SYP是突触的特异性标志物。本实验结果表明：① CBD能快速改善抑郁样小鼠的行为学表现；② CBD能快速上调抑郁样小鼠前额皮层中BDNF、PSD-95水平，及前额皮层与海马中SYP、mTOR水平表达。可见，CBD作用于抑郁样小鼠的积极作用与突触可塑性变化有关[6]。抑郁调控与mTOR 信号通路联系密切。有研究[7]发现，慢性不可预测性应激可诱导大鼠抑郁样行为，降低海马中mTOR信号活性。CBD可通过背侧海马中BDNF-TrkB-mTOR通路的激活从而发挥抗抑郁作用[8]，同时抑郁样小鼠内侧前额皮质的突触可塑性改变也与此有关[9]。本实验仍有局限之处，出于给药时间和剂量的考虑，本实验未进行小鼠脑的形态学检测。但可以明确的是，CBD可快速改善应激小鼠的抑郁样行为，且此作用与海马或前额皮层中BDNF、突触蛋白水平上调有关。