PEI-SPIO包裹的siRNA在小鼠肝癌存留时间的研究

杨 针，张文智，卢 鹏

(解放军总医院海南医院肝胆外科，海南三亚 572000)

肝癌是最常见的恶性肿瘤之一[1-3]，多数患者在得到确诊时已发展至晚期，失去了手术或其他根治性治疗的机会，而对于晚期肝癌患者的治疗效果仍未能令人满意。小干扰RNA(siRNA)在肿瘤基因靶向治疗中已成为研究热点，成为有希望的治疗策略[4-5]。siRNA是指具有特定长度和结构的RNA，由双链RNA被核酸内切酶切割而成[5-6]，主要通过互补序列的mRNA降解来调节基因的表达，在进化中高度保守，具有特异性、简单性及稳定性[7]。然而，siRNA在实际应用中存在着“脱靶”效应[8]、半衰期短、细胞摄取率低等问题，从而限制了其在抗肿瘤治疗中的应用。聚乙烯亚胺(PEI)是一种人工合成的阳离子纳米基因载体，广泛应用于质粒、核苷酸的传输[9]。PEI通过氨基上的正电荷与磁性纳米颗粒(SPIO)的羧基、siRNA磷酸基上的负电荷结合，再通过“质子海绵效应”将siRNA释放进而发挥RNA干扰作用[10]。有研究表明，聚乙烯亚胺修饰的磁性纳米颗粒(PEI-SPIO)与siRNA结合后能有效保护其不被核酸酶降解[11]，顺利穿过细胞膜进入细胞中，从而发挥RNA干扰作用[12]。如何将医用纳米技术应用在肝脏肿瘤的靶向治疗已成为研究的热点。本研究通过构建带有荧光素酶的C57BL/6小鼠原位肝癌模型，再将PEI-SPIO包裹的siRNA注入小鼠体内，进一步测试PEI-SPIO包裹的siRNA在C57BL/6小鼠原位肝癌中的摄取及siRNA在小鼠肿瘤滞留时间，从而为进一步研究PEI-SPIO包裹的siRNA在抑制小鼠肝癌生长的作用提供基础，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料

20只雌性C57BL/6小鼠，8周龄，体重20 g左右(购于空军军医大学动物中心)，饲养于空军军医大学医学实验动物中心，所有操作均符合空军军医大学科研伦理要求(审批号：XJYYLL-2014051)。小鼠肝癌luc-hepa1-6细胞系由本院实验室冻存。PEI-SPIO由空军军医大学药学系实验室合成，Cy5荧光标记的siRNA(Cy5-siRNA)由广州锐博公司合成。Matrigel基质胶购于美国Discovery Labware公司，细胞计数仪、小动物活体成像仪购于美国Caliper life science公司，微量进样器、D-Luciferin购于美国Goldbio公司。

1.2 方法

1.2.1细胞培养

luc-hepa1-6细胞完全培养基为15%胎牛血清的DMEM，细胞置于37 ℃的CO2孵箱中进行培养。

1.2.2luc-hepa1-6细胞胶悬液制备

将luc-hepa1-6细胞用胰酶消化，离心，细胞计数仪计数，最后用Matrigel基质胶稀释成8×107/mL的胶悬液。用微量进样器吸取胶悬液，放置于冰上防止其凝固。

1.2.3C57BL/6小鼠原位肝癌模型构建

用戊巴比妥钠对小鼠进行腹腔注射麻醉。将小鼠仰卧位固定于鼠板，以75%乙醇常规消毒，于下腹部正中线切开腹部皮肤，依次剪开皮肤、腹膜，由下向上至剑突下，充分暴露肝脏，将微量进样器刺入肝叶内约l cm，缓慢推注25 μL含有2×106个luc-hepa1-6细胞的Matrigel基质胶胶悬液，缓慢拔出微量进样器。逐层缝合关腹，再次乙醇消毒。

1.2.4活体监测小鼠体内成瘤情况

在小鼠接种原位肝癌第20天按10 μL/g体重浓度，加入相应体积的30 mg/mL D-Luciferin对小鼠进行腹腔注射。注射入体内15 min后，通过吸入2%异氟烷实施麻醉且在整个显像过程中持续吸入，将小鼠仰卧位摆放于LuminaⅡ活体成像系统的暗箱中，进行原位肝癌的活体成像。

1.2.5活体检测siRNA在小鼠体内的分布

在接种原位瘤后的第21天，通过尾静脉注射PEI-SPIO包裹的siRNA。先将PEI-SPIO在超声仪中超声1 h，然后将PEI-SPIO与Cy5-siRNA(siRNA的量按照与小鼠的体重比为0.5 g/kg)按照一定的比例复合，使其总体积达到400 μL，室温孵育30 min。将C57BL/6荷瘤小鼠固定在小鼠固定器中，尾静脉注射Cy5-siRNA或孵育好的PEI-SPIO与Cy5-siRNA的复合物。分别在注射后2、8、24 h用LuminaⅡ活体成像系统选择激发光波长在640 nm检测Cy5标记的siRNA在小鼠体内的分布情况。

1.2.6原位肝癌的病理检测

成像结束后，腹腔注射戊巴比妥麻醉，待麻醉后固定在小鼠版上，从心尖灌注生理盐水，灌注后留取肝脏、肾脏、脾脏等组织。经10%的甲醛固定液固定24～48 h，制备石蜡切片，苏木素-伊红(HE)染色进行常规染色检查。同时切片进行普鲁士蓝染色，检测PEI-SPIO在原位肝癌中的分布。

1.3 统计学处理

2 结 果

2.1 C57BL/6小鼠原位肝癌模型

在小鼠肝原左叶接种2×106个luc-hepa1-6细胞，接种后第21天用小动物活体成像系统检测小鼠原位肝癌的成瘤情况，结果显示luc-hepa1-6细胞系可在小鼠肝脏种植成瘤，见图1。

图1 小鼠接种后第21天原位肝癌的荧光图

2.2 活体检测siRNA在小鼠体内的分布

Cy5-siRNA和PEI-SPIO与Cy5-siRNA的复合物主要在肝脏、肾脏聚集。Cy5-siRNA于2 h在肝脏聚集达到高峰，很快转移至肾脏，8 h后可见荧光值开始降低，24 h肝脏部位荧光强度明显降低。而PEI-SPIO与Cy5-siRNA的复合物可在肝癌部位持续存在，24 h后仍可见到Cy5-siRNA的荧光值处于非常高的水平，见图2。

A.不同时间点Cy5-siRNA在小鼠肝脏肿瘤的荧光分布图；B.小鼠肝脏肿瘤Cy5-siRNA荧光值的统计分析图；a：P<0.05。

2.3 肝癌大体标本和病理学切片

小鼠灌注取材结果显示，肿瘤在小鼠肝脏左叶，其形态不规则呈结节状浸润生长，表明凹凸不平，质地较硬，见图3。病理切片HE染色结果显示，肝癌组织内的细胞为类圆形或不规则形细胞异型性明显，核质比明显失调，呈块状或团块状分布，见图4。

图3 接种后第21天后小鼠原位肝癌大体标本图

图4 小鼠原位肝癌病理图(HE，200×)

2.4 普鲁士蓝染色

切片普鲁士蓝染色镜下明显可见肝癌组织中SPIO的蓝色颗粒，证实PEI-SPIO在肝癌中聚集，并能携带siRNA到肿瘤组织中，见图5。

图5 小鼠原位肝癌普鲁士蓝染色结果(400×)

3 讨 论

近年来，siRNA被广泛应用于肿瘤的治疗之中，siRNA选择性地与mRNA的特异性序列结合从而持续抑制致病性蛋白的表达[13-14]，发挥其抑制肿瘤生长。医用纳米技术应用于肝癌的治疗中，已成为研究的热点，其为肝癌肿瘤的靶向治疗提供了新的研究方向[15-16]。本研究将纳米材料PEI-SPIO与siRNA结合，检验PEI-SPIO包裹的siRNA在小鼠原位肝癌的持续时间，为后续研究奠定基础。hepa1-6细胞是来源于C57小鼠的BW7756肝癌细胞系，所以，luc-hepa1-6细胞构建的小鼠原位肝癌模型在组织学上与人的肝癌高度相似，能够为本研究肝癌的发病机制、药物疗效评价及治疗方法提供动物模型。DUAN等[12]通过PEI-SPIO包裹的siRNA来治疗关节炎，结果发现相比于对照组，PEI-SPIO包裹的siRNA组能明显延长siRNA在小鼠体内的半衰期。因此，本课题组将PEI-SPIO与siRNA结合来验证PEI-SPIO在小鼠肝癌组织中保护siRNA的能力及延长其半衰期，从而为医用纳米技术应用于肝癌的治疗提供了新的方法。

本研究首先通过luc-hepa1-6细胞在C57BL/6小鼠肝左叶建立小鼠原位肝癌模型，在建立模型过程中选择肝左叶是因为小鼠肝左叶体积相对于其他肝叶大，能够容纳25 μL体积的细胞胶悬液。在小鼠接种原位肝癌后的第21天通过尾静脉注射Cy5-siRNA或PEI-SPIO与Cy5-siRNA的复合物，分别在注射后的2、8、24 h监测siRNA在小鼠体内的分布，结果发现Cy5-siRNA在小鼠肝癌中2 h到达高峰，8 h后可见siRNA的荧光值开始降低，24 h后不能见到siRNA的荧光值，而PEI-SPIO与Cy5-siRNA的复合物可在肝癌中持续存在，24 h仍可在肿瘤部位见到Cy5-siRNA聚集，说明PEI-SPIO包裹的siRNA能明显延长siRNA在小鼠肝癌组织中的半衰期。进一步灌注取材后可见肝左叶肿瘤组织，肿瘤病理切片证实为肿瘤细胞，同时可在肿瘤组织的普鲁士蓝染色中见到PEI-SPIO，证明SPIO能够携带siRNA进入肿瘤组织中，为进一步发挥siRNA干扰抑制的作用提供载体。

综上所述，通过将小鼠原位肝癌模型与PEI-SPIO包裹的siRNA结合建立的模型，为研究肝癌的治疗提供了新的思路，同时也为医用纳米材料对肿瘤的治疗提供了新的手段。PEI-SPIO包裹的siRNA能够到达小鼠原位肝癌部位，并在肿瘤组织中持续存在一定时间。因此，今后有望通过PEI-SPIO包裹的siRNA实现针对肝癌的基因治疗，提高肝癌的总体治疗效果。