非洲猪瘟检测样品的选择

许光勇 陈华林 周 磊

（1北京奶牛中心，北京 100192；2中国农业科学院北京畜牧兽医研究所，北京 100193；3北京中育种猪有限责任公司，北京 100194；4中国农业大学动物医学院，北京 100193）

非洲猪瘟(African swine fever,ASF)是猪感染非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)后呈现热性、出血性、高度接触性的一种传染病，临床上主要以发烧、出血、采食量下降或废绝、精神萎靡和流产为特征[1]。非洲猪瘟是世界动物卫生组织规定的法定报告动物疫病，我国将其列为一类传染病。自2018年非洲猪瘟首次出现在我国以来，其对生猪产业的发展影响巨大，最终导致2020年生猪行情创历史新高，同时也改变了我国生猪养殖模式与格局，此后集团化楼房养猪模式如“雨后春笋般拔地而起”。截至目前，没有任何有效的疫苗和药物可以控制非洲猪瘟[2]，规模化猪场主要依靠构建高级别的生物安全体系进行防控，当前，关口前置、早期诊断识别和精准剔除等核心技术是防控非洲猪瘟的关键。本试验主要以感染ASFV猪场为研究对象，对比猪群感染ASFV前期、中期、后期3个阶段，采集的环境样品、咽拭子、鼻拭子、肛拭子、静脉血和尾根血等样品中检测出ASFV核酸的敏感性，从而明确各个阶段诊断ASF所需采集的最佳样品种类，为指导猪场非洲猪瘟精准防控提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验猪

2021年感染ASFV的猪场，选择饲养于限位栏中，且临床症状以采食量下降或不食、发烧、流产为表现的母猪50头。

1.2 主要试剂

ZTLYB-Y64 Ex-DNA/RNA病毒核酸提取试剂盒(批号为21082310T035)，购自西安天隆科技有限公司；非洲猪瘟病毒核酸定量PCR检测试剂盒(批号为2021027)，购自北京明日达科技发展有限责任公司。

1.3 主要仪器

NP968-C全自动核酸提取仪、96R实时荧光定量PCR仪、PANA9600S全自动核酸工作站，西安天隆科技有限公司生产。

1.4 方法

时间点以母猪现场出现采食量下降或不食、发烧、流产、精神萎靡为第1 d，第1～3 d为感染前期，4～7 d为感染中期，8～21 d为感染后期。ASFV感染前、中、后期的异常母猪均采集个体对应的环境样品(料槽与排便区使用纱布滚轮或擦拭采集的样品)、咽拭子、鼻拭子、肛拭子、静脉血和尾根血6种样品。

1.5 非洲猪瘟病毒核酸检测

PCR反应(25 μL体系) 条件：50℃2 min；95℃3 min；95℃10 s，60℃20 s，40个循环。试验成立条件：阳性对照Ct值≤30，有明显指数增长，呈典型S型曲线；阴性对照无Ct值，无明显指数增长期和平台期。结果判定：检测样品Ct值≤40，有明显指数增长，则为ASFV核酸阳性；无Ct值判定为阴性。

2 结果与分析

采集试验所用50头异常母猪感染早期(1～3 d)、中期(4～7 d)和后期(8～21 d)的环境样品、咽拭子、鼻拭子、肛拭子、静脉血和尾根血6种样品共计900份，定量PCR检测ASFV核酸，其结果见表1。

由表1结果可知，ASFV感染前期咽部拭子样品非洲猪瘟病毒的阳性率最高，且与其他样品阳性率差别较大，Ct值最低，血液没有检出ASFV核酸。感染中期各类样品均可检出非洲猪瘟病毒核酸，其中尾根血非洲猪瘟病毒核酸阳性率最高为26%，静脉血与环境样品阳性率也较高，分别为20%和24%，比较接近，但血液样品的Ct值低于环境样品。感染后期，环境样品非洲猪瘟病毒核酸阳性率最高达54%，而血液样品的阳性率也在50%，血液Ct值低至26.9～28.7，而环境样品的Ct值为35.1，说明此阶段血液载毒量较高。

表1 不同感染阶段6种样品ASFV核酸结果

综合检测结果、现场操作便捷性与安全性等因素，认为ASFV感染不同阶段，其最佳检测样品分别为：非洲猪瘟病毒感染早期选择咽拭子样品、非洲猪瘟病毒感染中期选择尾根血、非洲猪瘟病毒感染后期选择环境样品。

3 讨论

非洲猪瘟传入我国已有3年，对生猪养殖行业造成巨大经济损失，非洲猪瘟是当前养猪场防控最重要的疫病，且其防控已呈现常态化[3]。当前，生物安全是控制非洲猪瘟最有效的措施，其关键措施包括分区管理、关口前置、日常监测等，均是围绕车辆、物资、人员、猪群、环境等5大主要载体开展工作。一旦非洲猪瘟病毒进入猪场感染猪群，需要有一套快速有效的应急反应预案，其核心就是在第一时间将ASFV感染控制在最小范围，阻止大面积交叉传播，以便现场开展精准剔除，将损失降至最低。ASF潜伏期或发病早期，快速准确识别出ASFV感染猪乃是精准剔除的关键环节。因此，本试验选择了环境样品、咽拭子、鼻拭子、肛拭子、静脉血和尾根血6种样品作为ASFV感染早期、中期和晚期检测ASFV核酸的研究对象，通过比较ASFV核酸阳性率和Ct值，明确了ASFV感染3个时期需选择的最合适的样品种类。

50头异常母猪于感染早期、中期和晚期采集环境样品、咽拭子、鼻拭子、肛拭子、静脉血和尾根血6种样品，提取病毒核酸后定量PCR检测ASFV核酸。由结果可知，因感染早期血液未检出ASFV核酸，所以血液一般不适用于ASFV感染前期的排查。虽然环境样品和肛拭子也检出了病毒核酸阳性，但咽拭子的阳性检出率更高。而鼻拭子中非洲猪瘟病毒核酸阳性检出率为20%，与咽拭子比较虽有差别，但采样方法简单便捷，必要时可考虑使用。因此，感染非洲猪瘟病毒早期最佳检测样品为咽拭子，其次是鼻拭子，该结论在理论上与ASFV感染后排毒的时间点相吻合。由于拭子采样方法需要直接接触猪乃口腔或鼻腔，因此，现场操作一定要关注采样人员的操作方式、更换佩戴手套、重复使用工具的消毒等细节，杜绝出现人为传播感染。

非洲猪瘟病毒感染中期6种样品均可检出ASFV核酸阳性，分别是尾根血、静脉血、肛拭子和环境样品的核酸阳性率在18%～26%之间，Ct值在31.3～36.1之间。结果表明，尾根血与静脉血检出ASFV核酸阳性率和Ct值均为最佳，综合考虑实验室检测和现场操作，最后认为尾根血采集更加便捷、安全。因此，非洲猪瘟病毒感染中期尾根血为检测ASFV核酸检测的最佳样品。虽然采集尾根血相对安全，但其所采集数量偏少，不利于开展多次检测，例如多次鉴别诊断。尾根血采集技术需要展开培训，否则采样效率会大打折扣。

非洲猪瘟病毒感染后期，除咽拭子外，其余5种样品仍可检出ASFV核酸阳性。环境样品、静脉血和尾根血核酸阳性率较高，肛拭子核酸阳性率也达到了26%，静脉血Ct值更是低至26.9。由此说明，非洲猪瘟病毒感染后期猪乃出现大量排毒。根据结果初步判定，静脉血、尾根血、肛拭子和环境样品均可作为检测样品。鉴于血液对环境、人员、工具等的污染风险较高，故肛拭子和环境样品优先选择；同时考虑到现场操作的便捷性和安全性，环境样品与肛拭子相比，前者具备采样更加方便、省时省力、不交叉污染等优点。因此认为，非洲猪瘟病毒感染后期环境样品是最适合的检测选择。环境样品是指收集猪群饲养区域、猪场内环境、载体表面等相关媒介，主要有尘土、料渣、口腔液与粪便等，其收集可借助于纱布和棉签等，环境样品的采集十分方便，具有一定独立性、交叉污染的概率较小。自2018年非洲猪瘟疫情在我国出现，环境样品大量应用于ASFV检测中，但由于正常运转猪场的部分环境样品携带ASFV病原载量较低，故其选择也具有局限性，王久红[4]监测了常态化条件下，养猪场局部区域环境样品ASFV核酸阳性率仅为0.63%，表明环境样品的选择确实存在局限性。乃有在猪群大量排毒或高剂量病原污染时，环境样品的检测效果较好。

4 小结

非洲猪瘟防控工作已然常态化，生物安全体系也越来越完善，且关键技术更加科学。本研究明确了猪感染ASFV前、中、后3个时期检测核酸的最佳样品种类，可以为ASF控制与精准剔除病猪提供更加清晰的思路与指导，进一步为促进生猪产业高质量发展提供有力支撑。