基于生物信息学探讨败酱散调控氧化应激缓解克罗恩病的机制

陆文鹏, 陈 民, 陈 洁, 郑新梅, 董小耘

(1. 扬州大学医学院, 江苏 扬州, 225000 2. 江苏省苏北人民医院 消化科, 江苏 扬州, 225000)

克罗恩病(CD)属于炎症性肠炎(IBD), 是一种影响胃肠道的慢性炎性肉芽肿性疾病[1-2]。目前, CD尚不能根治，西医主要以抗炎药、免疫抑制药物[3]和抗肿瘤坏死因子为主的生物制剂治疗，这些药物服用期间限制较多，且疗效有限；新型药物如抑制淋巴细胞迁移的调节剂、靶向肠道组织降解和重塑的抑制剂等尚在研发中[4]。中医药辨证论治CD，具有独特疗效。

CD的临床特点与中医的“肠痈”“肛庸”“痔漏”“流注”相似，临床可从“肠痈”的角度来论治CD[5]。败酱散是治疗肠痈代表方[6], 出自《金匮要略》，由薏苡仁、附子、败酱草三味药组成，该方能排脓消痈，振奋阳气，临床应用广泛，对IBD疗效显著[7]。目前对该方治疗溃疡性结肠炎(UC)研究较多, CD与UC早期难以鉴别，根据中医辨证论治思想，该方亦适用于CD, 但对其治疗CD作用机制的研究较少。本研究基于生物信息学探讨败酱散调控氧化应激(OS)缓解CD的活性成分、潜在靶点、通路及机制，为进一步实验提供方向。

1 数据库及软件

TCMSP数据库(https://tcmspw.com/tcmsp.php); Uniprot数据库(https://www.uniprot.org/); GEO数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/); String11.5在线平台(https://stringdb.org); Genecards数据库(https://www.genecards.org/); Enrichr数据库(http://amp.pharm.mssm.edu/Enrichr/); Mirtarbase数据库(http://mirtarbase.mbc.nctu.edu.tw/index.html); Starbase数据库(https://starbase.sysu.edu.cn); Targetscan数据库(http://www.targetscan.org/vert_71/); Rstudio软件或R4.1.2软件; Cytoscape3.8.2软件。

2 资料与方法

2.1 CD相关靶点筛选

利用GEO数据库，以“crohn′s disease”为检索词，通过筛选，下载GSE36807、GSE59071、GSE102133数据集以及对应GPL平台文件，将上述数据集中CD组(CD,n=86)以及对照组(正常,n=30)合并、矫正，使用R软件利用“Limma”包以lgFC>1、矫正后P<0.05为条件筛选出差异表达基因，将这些基因作为疾病作用靶点。

2.2 药物活性成分及靶点筛选

以口服利用度(OB)≥30%, 类药性(DL)≥0.18为有效活性成分筛选条件，在TCMSP数据库筛选，获取薏苡仁、附子、败酱草3味中药有效成分。结合TCMSP中Relate Targets的文件得到有效成分对应的靶点，再通过Uniprot数据库中注释文件，将靶点名转化为基因名。

2.3 OS相关基因获取

在Genecards数据库中以“oxidative stress”为关键词搜索相关基因，以“Relevance score≥7”为条件筛选获得OS相关基因。

2.4 药物与疾病共同靶点筛选及作用靶点网络构建

将2.1中的疾病靶点与2.2中药物靶点以及2.3中获取的OS相关基因取交集，绘制韦恩图，得到共同靶点数据，将其导入Cytoscape, 同时将上述“2.2”获得的活性成分及靶点关系数据导入进行调控网络构建。

2.5 蛋白互作(PPI)网络图构建与核心靶点筛选

将共同靶点导入String数据库，获取PPI网络图。下载TSV文件，导入Cytoscape软件，使用Cytohubba插件筛选出核心靶点。Cytohubba可准确筛选出网络中的重要节点，其中最大集团中心度(MCC)算法已被证实是预测重要靶点较为精确的方法[8]。

2.6 基因富集分析

通过R软件中相关的Bioconductor安装包，设置P=0.05,Q=0.05, 进行靶点基因的基因本体(GO)富集分析，保存富集结果并选取生物过程、细胞组分、分子功能各自前10位绘图。采用同样方法进行京都基因与基因组百科全书(KEGG)分析，并绘制与本研究相关的信号通路图。

2.7 微小RNA(miRNA)、转录因子(TF)预测及调控网络构建

使用Mirtarbase[9]、Starbase[10]和Targetscan[11]数据库预测共同靶点的靶向miRNA。取3个数据库交集miRNA作为预测的靶向miRNA。与共同靶点相关TFs在Enrichr数据库以P≤0.05为条件预测。将三者调控关系导入Cytoscape软件绘制调控网络图。

3 结 果

3.1 CD靶点筛选结果

在GEO数据库中获取CD相关数据: GSE36807、GSE59071、GSE102133数据集，选取其中正常组以及CD组，对数据进行归一化处理、合并、批次矫正。差异分析共得到差异基因175个，其中上调基因135个、下调基因40个，数据信息见表1。

表1 数据集信息表

3.2 药物成分及靶点筛选结果

使用TCMSP数据库搜索药物的成分，筛选后得到有效成分: 薏苡仁9个，附子21个，败酱草13个，见表2。

表2 药物有效成分

3.3 活性成分与作用靶点网络图

将败酱散调控靶点与CD差异基因以及OS相关基因取交集，共有14个基因，得到图1A及交集数据，将交集数据以及药物成分与靶点关系导入Cytoscape软件，绘制调控网络图1B, 包含30个节点、39条边，其中潜在基因靶点14个，对应的有效成分16个。对应靶点较多的败酱草的活性成分槲皮素对应11个靶点，其次是山奈酚对应6个靶点; 对应活性成分较多的靶点是前列腺素内过氧化物合成酶2(PTGS2, 对应16个活性成分)，细胞间黏附分子-1(ICAM1)、一氧化氮合酶2(NOS2)和基质金属蛋白酶1(MMP1)分别对应3个活性成分，可能为败酱散调控OS缓解CD的重要靶点。

3.4 PPI网络与核心靶点

将14个共同靶点基因导入String数据库，设置置信度≥0.4, 并剔除独立于网络以外的靶点可得到图2A, 获取PPI相关信息，利用Cytoscape软件对PPI信息进行可视化，并使用Cytohubba插件筛选排名前5的核心基因，见图2B、表3。

表3 MCC得分前5位基因列表

3.5 富集分析

使用R软件对作用靶点基因进行GO富集分析得到图3。结果显著富集于调控脂多糖(response to lipopolysaccharide)、调控细菌起源的分子(response to molecule of bacterialorigin)、细胞外间质组织(extracellular matrix organization)、细胞外结构组织(extracellular structure organization)等生物过程; 薄膜筏(membrane raft)、膜微区(membrane microdomain)等细胞组成; 丝氨酸型内肽酶活性(serine type endopeptidase activity)等分子功能。

使用R软件进行KEGG富集分析，共富集到35条通路关系，排第1的晚期糖基化终产物及其受体(AGE-RAGE)信号通路图见图4, 该信号通路内含有丝裂原活化蛋白激酶(MAKP)、磷脂酰肌醇3′-激酶(PI3K-AKT)等信号通路，且涉及OS反应，可能是败酱散调控OS缓解CD的重要通路。对应靶点数大于5的通路见表4。

表4 KEGG分析对应靶点数大于5的通路

3.6 miRNA-TF-mRNA调控网络

Mirtarbase数据库中预测出486个miRNA, Starbase数据库预测出185个miRNA, Targetscan数据库预测出4 679个miRNA, 3个数据库预测共有76个miRNA。Enrichr数据库中筛选出转录因子(TF)共5个，分别是甲状腺素受体(THRA)、含葡萄球菌核酸酶域1(SND1)、转录因子Sp4(SP4)、母亲DPP同源物3(果蝇)SMAD(SMAD3)、v-rel网状内皮细胞过多症病毒癌基因同源物A, B细胞κ轻肽基因增强子核因子3, p65(鸟类, RELA), 这些miRNA、TF参与调控的通路可能与败酱散调控OS缓解CD有关。miRNA-TF-mRNA调控网络见图5, 有93个节点, 343个边。红色圆形代表预测的TF, 蓝色三角形是共同靶点基因，绿色正方形是miRNA。

4 讨 论

目前, CD的病因、病机尚未明确，可能与遗传因素、机体免疫功能、神经-体液调节功能、生活习惯及环境因素、肠道微生物等[12]相关。研究[13]发现，溃疡的发生发展与OS密切相关, CD常伴有溃疡。OS在CD发病机制中的关键作用已得到广泛认可，但具体机制仍未阐明。

OS的发生与抗氧化能力和自由基即活性氧(ROS)、活性氮(RNS)及其他未配对电子的分子平衡有关，过量自由基会导致氧化负荷与抗氧化能力失衡[14]发生OS; 同时OS可导致中性粒细胞炎性浸润，蛋白酶分泌增加，产生大量ROS。ROS一方面能参与细胞稳态; 另一方面除了对细胞产生直接损害，还可与DNA、脂质、氨基酸、细胞发生反应导致衰老、疾病和细胞死亡[15]。研究表明, CD中OS的发生与自由基、各种参与OS的酶、环境因素有关。

败酱散活性成分中的槲皮素具有抗自由基、抗氧化、抗菌抗炎、免疫调节等功能，研究[16]表明其可增强抗氧化酶活性，减少自由基生成，从而抑制OS发生。槲皮素可作用于AKT-PKB-mTOR、Nrf2-ARE[17-18]等多种信号通路，参与OS发生。山奈酚是一种众所周知的抗氧化剂，能通过激活腺苷酸活化蛋白激酶/烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶4(AMPK/NOX4)等信号通路，抑制细胞增殖、ROS产生、NOX4等表达[19]缓解OS。

蛋白互作网络筛选出的核心基因有IL-1β、PTGS2、CXCL8、ICAM1、KDR。研究[20]表明, IL-1β能激发OS, 致使多种细胞衰老, CD中IL-1β表达升高，下调其表达能促进结肠炎性损伤的恢复[21]。PTGS2也被称为环氧化酶-2(COX-2), 是CD活动期关键基因[22]。研究[23]发现，肿瘤坏死因子-α(TNF-α)通过调节p38丝裂原活化蛋白激酶(P38-MAPK)通路产生PTGS2和热休克蛋白27(Hsp27), 刺激结肠肌成纤维细胞迁移，致使CD发生。CXCL8在CD患者中高表达，且与疾病活动相关[24], 未受刺激的细胞中几乎难以检测到CXCL8, 其表达可受包括ROS在内的多种因素的刺激调控[25]。ICAM1属于黏附分子免疫球蛋白超家族，参与机体免疫功能、炎症反应等的调控，其表达量在CD发病中显著升高[26], OS可快速激活MAPK通路，刺激ICAM1转录[27]。KDR是血管上皮因子受体，与血管内皮生长因子(VEGF)结合后，可介导内皮细胞增殖，促进血管生成[28], 减轻炎症反应及OS反应。

富集分析中涉及AGE-RAGE、核因子κB(NF-κB)、肿瘤坏死因子(TNF)等信号通路。研究[29]发现AGE-RAGE信号通路激活在CD的局部炎症级联反应中起重要作用。激活该通路可以提高烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)氧化酶活性，促进ROS产生，使OS过度激活，经级联反应诱导细胞凋亡、变性坏死，加重微血管病变[30]。NF-κB通路对细胞自噬有抑制作用，研究[31]发现抑制NF-κB通路表达，能激活CD模型小鼠结肠自噬表达。同时NF-κB是氧化应激时细胞内的靶点，参与氧化还原调节, CD患者体内产生的大量自由基，除了直接损伤肠黏膜屏障外，还可激活NF-κB通路，导致肠道发生炎性反应[32]。在CD炎症过程早期, TNF-α即可被检测到[33]。抗TNF-α治疗是治疗CD的手段之一，该方案对重度和具有2种及以上不良预后危险因素的CD患者有较好疗效[34], 这与抗TNF-α疗法可减轻CD患者的氧化应激有关。在CD中有表达差异的miRNA可作为诊断生物标志物。本研究预测的76个miRNA中, miR-145-5p被证实通过抑制性别决定区域Y(SRY)相关的高迁移率族框9(SOX9)表达和恢复靠停蛋白8(CLDN8)表达来缓解三硝基苯磺酸9(NBS)诱导CD小鼠结肠炎症[35]。OS能通过NF-κB信号通路诱导miR-122的DNA甲基化，促进CD的进展[36]。

本研究结合OS相关差异基因，探讨OS缓解CD相关机制。本研究采用生物信息学分析发现败酱散调控OS可能与IL-1β、PTGS2、CXCL8、ICAM1、KDR等靶点有关，涉及通路主要为AGE-RAGE、NF-κB、TNF信号通路等，同时还预测了相关miRNA以及TF。但本研究以预测为主，其准确性还有待进一步进行体内外实验探讨。