57份小麦微核心种质苗期耐盐鉴定及分子标记评价

宋楠，陈家婷，郭慧娟，常利芳，张树伟，陈芳，李欣，张晓军，畅志坚，乔麟轶

（1.山西大学 生命科学学院，山西 太原 030006；2.山西农业大学 农学院，山西 太原 030031）

小麦（Triticum aestivumL.）是世界上种植面积最大的粮食作物之一，为人类生存提供基本食物保障[1]。目前，育种家采用品种改良方法可使小麦单产每年提高约0.9%，但随着全球人口增长以及对粮食需求的增加，小麦单产增长速率需要达到2%以上[2-3]，才能满足人类社会发展需求，因此，进一步发掘小麦增产潜力迫在眉睫。土壤盐渍化是影响小麦生长发育和产量形成的主要非生物胁迫之一。当前，全球土壤面积有10%发生盐渍化，其中，我国土壤盐渍化面积达3.6×107hm2[4]，严重制约小麦增产，因此，广泛发掘耐盐种质用于小麦品种抗逆性改良是利用盐碱地扩大小麦种植面积和提高盐碱地小麦单产的最经济有效途径之一。近年来，国内外小麦耐盐种质筛选与品种改良逐渐被科学界重视。KHAN等[5]对24份小麦种质进行盐胁迫处理，筛选出了7份苗期具有较强耐盐性的种质V-8001、LU26s、Bhittai、C-228、KTDH、KTDH-22和DS-17；HUSSAIN等[6]利用苗期盐胁迫试验鉴定了40份小麦品种，选出3份耐盐材料S-24、LU-26S和Pasban-90；OYIGA等[7]从150份小麦品种中鉴定出3份 耐 盐 材 料Altay2000、14IWWYTIR-19和UZ-11CWA-8；张巧凤等[8]评价了293份小麦种质的苗期耐盐性，筛选出5份耐盐新种质Marmin-Minhardi×H44-Minturki、圆白壳小麦、花树蒲、和尚麦和顶籽；刘旭等[9]从400份小麦种质中筛选出3份耐盐材料：红蚂蚱、希望、科遗26。上述种质的筛选为小麦品种的耐盐性改良提供了重要资源，但仍有大量高耐盐性种质仍未得到鉴定和利用。

为了高效发掘小麦耐盐种质，本研究在YU等[10]利用芽期耐盐指数评价核心种质的基础上，以郝晨阳等[11]利用分子标记筛选的小麦微核心种质为材料，开展苗期盐胁迫鉴定，并利用盐害指数（Salt injury index，SI）筛选耐盐种质，同时利用分子标记分析其可能携带的耐盐位点，以期为小麦抗盐育种提供一定的理论参考。

1 材料和方法

1.1 试验材料

57份小麦微核心种质[12]包括42份农家种、12份育成品种和3份引进品种，由作物遗传与分子改良山西省重点实验室保存。另设置小麦品种旱选10号作为耐盐对照、中国春作为盐敏感对照。

1.2 盐胁迫处理

每份种质选取20粒饱满种子，经1%双氧水消毒后用去离子水冲洗，将其置于铺有滤纸的培养皿内，籽粒腹沟朝下，加水萌发。当胚根生长至2～3 cm时，从中选取8粒生长势一致的种子转移至盛有1/2霍格兰氏营养液的培养皿，置于恒温培养箱，设置参数：16 h光照/22℃，8 h黑暗/16℃；7 d后，待幼苗长至两叶一心，用含NaCl的1/2霍格兰氏营养液进行盐胁迫处理，14 d后进行表型鉴定，3次生物学重复。

利用200、250、300、350、400 mmol/L等5个盐浓度分别测试对照品种旱选10号和中国春的苗期耐盐性，将二者盐害指数差异最大时对应的盐浓度作为鉴定微核心种质的盐胁迫浓度。

1.3 表型鉴定与数据分析

采用张潇文等[13]方法，将小麦植株耐盐级别划分为0～4级，并计算每份种质的盐害指数（SI）。

其中，N指植株数目，本研究中N=8。依据盐害指数对小麦种质做总体评价，分别为：高感（80.1%～100%）、敏感（60.1%～80.0%）、中耐（40.1%～60.0%）、耐盐（20.1%～40.0%）以及高耐（0～20.0%）。

1.4 耐盐分子标记鉴定

采用改良CTAB法提取小麦叶片基因组DNA。根据文献[14-17]合成74个耐盐相关分子标记，扩增微核心种质DNA，从中选择24个多态性稳定、条带清晰的标记用于相关性分析（表1）。

表1 24个用于种质评价的耐盐相关分子标记及序列Tab.1 The sequences of 24 salt-tolerance-related molecular markers for evaluation of germplasm resources

续表1 24个用于种质评价的耐盐相关分子标记及序列Tab.1（Continued）The sequences of 24 salt-tolerance-related molecular markers for evaluation of germplasm resources

PCR反应体系为：ddH2O 2μL，PCR Mixture 5μL，引物1.5μL，DNA（50 ng/μL）1.5μL。PCR反应程序：95℃30 s；58℃30 s，72℃30 s，36个循环。PCR扩增产物在8%非变性聚丙烯酰胺凝胶中电泳，经硝酸银染色、显影液显色后拍照保存。

1.5 数据分析

采用Microsoft Excel 2020软件对数据进行统计分析，以及作图。

2 结果与分析

2.1 筛选苗期耐盐浓度

小麦种质苗期耐盐鉴定浓度的筛选如图1所示。

图1 小麦种质苗期耐盐鉴定浓度的筛选Fig.1 Screening of concentration for salt-tolerance identification of wheat germplasm at seedling stage

利用5个盐浓度分别测试对照品种旱选10号和中国春的苗期耐盐性，结果表明（图1），随着NaCl浓度升高，旱选10号和中国春的盐害指数不断增加。当NaCl浓度为250 mmol/L时，耐盐对照旱选10号和盐敏感对照中国春的盐害指数差异达到最大。因此，选择250 mmol/L作为鉴定微核心种质的盐胁迫浓度。

2.2 57份微核心种质苗期耐盐鉴定

57份微核心种质苗期盐害指数分布及耐盐等级如图2、3所示。

图2 57份微核心种质苗期盐害指数分布Fig.2 Distribution of salt injury index of 57 micro-core germplasms at seedling stage

用250 mmol/L NaCl溶液对57份微核心种质进行苗期盐胁迫处理，结果显示，57份小麦微核心种质的盐害指数呈正态分布（图2），表现为高感、敏感、中耐、耐盐、高耐的种质分别有5、21、24、6、1份，占比分别为8.8%、36.8%、42.1%、10.5%、1.8%（图3），其中，评价等级为耐盐及以上（SI＜40.00%）的有7份：带芒红麦、黄瓜先、半截芒、小偃6号、兴义4号、Atlas 66、和尚麦。与此同时，小偃6号与耐盐对照旱选10号盐害指数一致，均为30.00%，且带芒红麦（14.24%）、黄瓜先（25.00%）和半截芒（28.89%）的耐盐性明显高于旱选10号，尤其是带芒红麦盐害指数最小，评价等级为高耐（表2）。

图3 57份微核心种质苗期耐盐等级及数目Fig.3 Salt tolerance grades and numbers of 57 microcore germplasms at seedling stage

表2 57份微核心种质苗期耐盐表型Tab.2 Salt tolerance phenotypes of 57 micro-core germplasms at seedling stage

2.3 分子标记评价

利用74个耐盐相关分子标记扩增57份微核心种质，有24个标记的等位变异数目＞2个，多态信息含量（Polymorphic Information Content，PIC）在0.28～0.47，多态性稳定，因此，将其用于后续相关性研究。方差结果发现，分子标记Xcfd9在供试种质中具有3种标记型（图4），其中，标记型为a的种质平均盐害指数为49.59%，b型种质平均盐害指数为57.06%，c型种质平均盐害指数为64.76%，且每种标记型对应的苗期盐害指数之间存在显著差异（F＞F0.05，P=0.04），表明Xcfd9与供试种质耐盐性存在显著相关（表3、4）。其余23个分子标记与供试种质耐盐指数之间的相关性不显著。

表3 Xcfd9在微核心种质中的标记型及盐害指数Tab.3 Genotype and salt injury index of Xcfd9 in micro-core germplasm

图4 Xcfd9标记在部分微核心种质中的标记型Fig.4 Genotypes of Xcfd9 in parts of micro-core germplasms

表4 Xcfd9的3种标记型对应表型值方差分析Tab.4 Variance analysis of corresponding phenotypic values of genotypes of Xcfd9

3 结论与讨论

耐盐种质筛选是小麦抗盐育种工作的重要前提。目前小麦耐盐鉴定主要采用形态指标、生理指标和产量指标3种方法，其中，形态指标主要指小麦叶片或根系受胁迫前后的各项参数的测定，因其操作简便、适合室内鉴定，被广泛用于小麦抗逆性评价[17-18]。叶片盐害指数法对小麦盐胁迫评价较为成熟，曾有研究利用该方法从小麦耐盐品种中确定了耐盐位点，并分离了耐盐基因TaSRO1[19-20]。因此，本研究对57份小麦微核心种质3叶期幼苗进行盐胁迫，随后根据叶片反应型来计算盐害指数，并以旱选10号作为耐盐对照品种[21-22]，结果显示，供试小偃6号（小麦生产中公认的耐盐品种）与旱选10号的盐害指数一致（SI=30.00%），表明所用的评价体系准确，鉴定结果可信。与此同时，从57份微核心种质中鉴定出7份盐害指数低于40.00%的耐盐种质，占比为12.3%，表明小麦种质的整体耐盐性不高，与前人研究结果一致[10]，其中有4份为农家种（带芒红麦、黄瓜先、半截芒、和尚麦），2份为栽培种（小偃6号、兴义4号），1份为引进种（Atlas 66）。前人研究发现，从美国引进的小麦Atlas 66具有发达的根系[23]，且对高铝土壤具有很好的耐受性[24]；小偃6号是我国小麦栽培品种的骨干亲本之一，可以通过降低地上部组织中Na含量来提高植株耐盐性[25]；半截芒和和尚麦则分别对镉和铅表现出很好的耐受性[26]，但兴义4号、带芒红麦和黄瓜先尚无与非生物胁迫相关的研究报道，尤其是带芒红麦盐害指数仅为14.24%，后续将有可能成为创制小麦耐盐材料和改良品种的重要材料。

同时，本研究用24个多态性标记对57份供试微核心种质进行分子评价，重点关注了标记型与种质盐害指数之间的相关性，结果发现，Xcfd9与供试种质的苗期耐盐性存在显著相关（F＞F0.05，P=0.04），标记型为a和b的种质整体耐盐性为中耐，而标记型为c的种质整体表现为盐敏感。在中耐标记型中，a型种质（包括带芒红麦和小偃6号）表现出最低的平均盐害指数（49.59%）；其次为b型种质（包括黄瓜先、半截芒、和尚麦、兴义4号和Atlas 66），平均盐害指数为57.06%，表明Xcfd9附近存在1个耐盐位点，该结果与LIU等[16]的研究结果一致：Xcfd9与小麦3D染色体上的芽期耐盐相关位点QGT、QAA和QWURH连锁。

综上所述，本研究供试微核心种质的耐盐表型与Xcfd9的a或b标记型连锁，并且筛选出的7份耐盐种质均携带这个耐盐位点，在利用这些种质改良小麦品种过程中，可将Xcfd9用于标记辅助选择。